论文部分内容阅读
大骨节病(Kaschin-Beck Disease, KBD)是一种地方性骨关节病,对人体的危害极大,至今,KBD发病原因与发病机制仍困扰着科学家。本实验从感染青海大骨节病病区粮食作物内生真菌的代谢产物出发,探讨其中究竟有哪种或哪些物质能够对软骨细胞造成损伤,从而为大骨节病病因的寻找提供一定的实验参考。本实验选取分离自青海大骨节病区小麦内生镰孢霉5-5-1菌株代谢产物中对软骨细胞损伤严重的石油醚分部进行实验。通过硅胶柱层析、薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、气相-质谱联用(GC/MS)等方法,对石油醚分部的代谢产物进行逐级分离。主要通过MTT检测软骨细胞存活率,免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的合成量,甲苯胺蓝染色(toluidine blue, TB)检测蛋白聚糖的合成量,半定量RT-PCR实验检测Ⅱ型胶原蛋白与蛋白聚糖mRNA的表达量来逐级筛选能造成兔软骨细胞损伤的目标物质。实验结果显示,从石油醚分部中经柱层析粗分离得到的A、B、C、D、E、F、G、H这8组样品中,E、F、G样品均能够抑制软骨细胞的存活率、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成及其mRNA的表达,且均呈一定的浓度与时间效应。鉴于相同浓度下F样品对兔软骨细胞各项指标的影响最大,因此对F样品再进行HPLC分离。根据HPLC图谱结果,将其分为F1、F2、F3三部分。将它们分别作用于兔软骨细胞,结果显示F1、F2样品能对软骨细胞的存活率、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成及其mRNA的表达均产生抑制作用。而F3样品对兔软骨细胞的各项指标均无影响。对F1样品进行GC/MS分析,显示F1中可能存在镰孢霉毒素蛇形菌素(4,15-diacetoxyscirpenol, DAS),经HPLC分析与DAS标准品进行对比验证,确认DAS的存在,且不同浓度的DAS对软骨细胞的存活率、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成及其mRNA的表达均产生抑制作用,呈一定的浓度与时间效应,这是关于该毒素对软骨细胞有毒损作用的首次报道。同样对F2样品进行HPLC与GC/MS分析,发现其成分较复杂,有待进一步分离纯化鉴定。以上实验结果表明,镰孢霉5-5-1菌株代谢产物石油醚提取物分级分离产物中含有DAS及其他能够损伤软骨细胞的物质,并证实了KBD病区植物内生真菌代谢产物中含有多种损伤软骨细胞的物质,这些研究结果将为大骨节病病因的研究提供新的参考。