【摘 要】
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多聚免疫球蛋白受体（polymeric immunoglobulin receptor,pIgR）是介导多聚免疫球蛋白（包括pIgA和pIgM）转运通过粘膜上皮细胞的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。pIgR在上皮细胞的基底面与pIgA/pIgM以共价键结合,发生细胞内吞将配受体复合物摄入细胞内并转运到细胞的顶生面,与pIgA/pIgM结合的pIgR胞外配体结合区即分泌组分（secretory componen
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多聚免疫球蛋白受体（polymeric immunoglobulin receptor,pIgR）是介导多聚免疫球蛋白（包括pIgA和pIgM）转运通过粘膜上皮细胞的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。pIgR在上皮细胞的基底面与pIgA/pIgM以共价键结合,发生细胞内吞将配受体复合物摄入细胞内并转运到细胞的顶生面,与pIgA/pIgM结合的pIgR胞外配体结合区即分泌组分（secretory component,SC）被蛋白水解酶切下形成分泌性免疫球蛋白（SIgA/SIgM）释放到粘液中,空载的pIgR也会被酶切产生游离的SC单体。pIgR和SC可以保护免疫球蛋白免受蛋白酶的降解,在黏膜免疫中起到了关键的作用。pIgR在生物进化过程中非常保守,已经在多种生物中展开了广泛的研究。本研究通过分子克隆、基因重组技术,在体外成功地克隆了编码鲤鱼pIgR胞外段的基因,经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后定向连接到pET-28a（+）原核表达载体上,构建了pET-28a/pIgR重组表达质粒,将阳性重组质粒转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3）。电泳结果显示,经过1mM IPTG诱导后在菌体中表达了包涵体形式的pIgR原核蛋白,分子量为29.2KDa。切胶制备抗原免疫新西兰大白兔,获得效价为1:8的兔抗鲤鱼pIgR抗血清,能够与原核表达的pIgR蛋白进行反应,但是这种抗血清能否与天然状态的pIgR结合尚不清楚。为了研究鲤鱼pIgR的功能,我们对鲤鱼不同组织pIgR的表达差异发现黏膜相关组织中pIgR的表达量较高,其中以肝脏、脾脏、后肠、鳃、口腔上皮和皮肤中尤为显著。经过灭活鳗弧菌浸泡免疫刺激后,用实时定量PCR的方法检测鲤鱼中肠pIgR表达变化,发现免疫刺激后pIgR的表达量先急剧升高,在第3天后恢复到正常水平,说明菌体成分LSP能够上调pIgR的表达,而且pIgR能够参与对LSP引起的免疫刺激的有效防御,保护鱼体抵抗病原菌的侵袭。利用兔抗鲤鱼pIgR抗血清,用免疫组织化学染色的方法确定了pIgR在鲤鱼不同组织中的定位,为进一步研究pIgR的功能奠定了坚实的基础。为了得到高效特异的抗血清,我们进行了基因免疫实验。首先设计带有kozak序列和ATG序列的pIgR片段,两端的酶切位点分别为BamHⅠ、HindⅢ,连接到真核载体pcDNA3.1/myc-His（-） A中。然后提取无内毒素的高纯重组质粒pcDNA3.1/pIgR,使其符合基因免疫的标准。对实验组4周龄昆明雄鼠进行多次小剂量后肢骨骼肌肌肉注射,获得鼠抗鲤鱼pIgR抗血清。在进行上述DNA免疫的过程中,我们将pIgR基因片段以XhoⅠ和HindⅢ双酶切位点从pcDNA3.1/pIgR切下,插入到含有增强型绿色荧光蛋白基因的pEGFP-1N载体中,转染293T细胞,检测不同时间段pIgR-EGFP融合蛋白的表达情况。收集真核表达蛋白与鼠抗鲤鱼pIgR抗血清进行western-blot反应,检测抗血清的特异性,由此确定鼠抗鲤鱼pIgR抗血清能够和原核及真核表达的pIgR蛋白进行反应,证明该抗血清可以作为后续实验的工具。
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