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第一部分:DA-CH5对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性的保护机制研究目的:1.研究DA-CH5能否改善6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞模型毒性作用;并揭示DA-CH5神经保护作用的机制。2.探究6-OHDA诱导的细胞模型中,GLP-1/GIP双受体杂合肽DA-CH5相对于GLP-1受体激动剂Exendin-4是否更具有优势。方法:1.实验分组:经4 h血清休克后,我们以6-OHDA与Exendin-4或DA-CH5共同孵育的方式将实验分为以下6组:(1)CNTRL;(2)Exendin-4;(3)DA-CH5;(4)6-OHDA;(5)6-OHDA+Exendin-4;(6)6-OHDA+DA-CH5。2.MTT细胞生存率检验:将细胞均匀的接种在96孔板内,经过4 h血清休克后,加入(150μM,250μM,350μM,450μM)梯度浓度的6-OHDA孵育24 h。随后将5mg/m L MTT溶液加入各个孔中,37℃放置3 h后经酶标仪检测其OD值。筛选出最适造模浓度后,再将该浓度的6-OHDA与100n M Exendin-4或100n M DA-CH5共同加入培养基中孵育24 h后,再检测其OD值。3.DCFH-DA探针检测活性氧簇水平:将已加药干预过的细胞孵育在含有10μM DCDH-DA的PBS中,15 min后再经PBS清洗,置于流式细胞仪中检测荧光信号强度。4.采用Western blot实验检测如下蛋白表达水平:(1)凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、p-Badser136、t-Bad;(2)胰岛素信号通路蛋白p-IRS-1ser312、t-IRS-1、p-AKTser473、p-CREBser133、t-CREB;(3)线粒体功能相关蛋白PGC-1α、NRF-1;(4)自噬相关蛋白SQSTM1、Beclin-1。并且用GAPDH或β-actin作为内参照。结果:1.MTT细胞生存率检验结果:(1)经350μM 6-OHDA孵育24小时后,其细胞生存率较正常对照组下降显著(P<0.001;vs.CNTRL group)。故而我们将该浓度的6-OHDA溶液作为细胞模型的造模条件。(2)6-OHDA+Exendin-4(P<0.05;vs.6-OHDA group)和6-OHDA+DA-CH5(P<0.001;vs.6-OHDA group)两组的细胞生存率均较6-OHDA造模组有显著提高。并且,6-OHDA+DA-CH5组较6-OHDA+Exendin-4组提升更为显著(P<0.01;vs.6-OHDA+Exendin-4 group)。2.DCFH-DA探针检测活性氧簇水平结果:与正常对照组相比,6-OHDA组中的活性氧簇显著增多(P<0.001;vs.CNTRL group)。而6-OHDA+Exendin-4(P<0.001;vs.6-OHDA group)和6-OHDA+DA-CH5(P<0.001;vs.6-OHDA group)两组的活性氧簇水平均较6-OHDA造模组有显著下降。并且,与6-OHDA+Exendin-4组相比6-OHDA+DA-CH5组有较小的改善(P<0.05;vs.6-OHDA+Exendin-4 group)。3.Western blot结果:(1)Exendin-4(Bax,P<0.01;Bcl-2,P<0.05)与DA-CH5(Bax,P<0.001;Bcl-2,P<0.01;vs.6-OHDA group)均能显著改善6-OHDA诱导的凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达异常。而只有DA-CH5(P<0.01;vs.6-OHDA group)可显著提高p-Badser136表达水平。(2)Exendin-4(P<0.05;vs.6-OHDA group)与DA-CH5(P<0.05;vs.6-OHDA group)均可改善p-IRS-1ser312异常表达。并且Exendin-4(p-AKTser473/t-AKT,P<0.001;p-CREBser133/t-CREB,P<0.01;vs.6-OHDA group)与DA-CH5(p-AKTser473/t-AKT,P<0.001;p-CREBser133/t-CREB,P<0.01;vs.6-OHDA group)均可提高IRS-1下游的信号大分子p-AKTser473与p-CREBser133的表达。(3)只有DA-CH5(PGC-1α,P<0.05;NRF-1,P<0.01;vs.6-OHDA group)可改善6-OHDA诱导的线粒体功能相关蛋白PGC-1α和NRF-1表达降低,并且与Exendin-4相比,NRF-1表达水平在6-OHDA+DA-CH5组(P<0.05;vs.6-OHDA+Exendin-4group)中的提高具有统计学意义。(4)相对于正常对照组,Exendin-4(SQSTM1,P<0.01;Beclin-1,P<0.05;vs.CNTRL)与DA-CH5(SQSTM1,P<0.01;Beclin-1,P<0.01;vs.CNTRL)均可引起自噬相关蛋白SQSTM1与Beclin-1的表达量提高。结论:Exendin-4和DA-CH5可有效的抑制6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞生存率降低以及活性氧簇升高。又通过调节IRS-1/AKT/CREB通路改善凋亡相关蛋白的异常表达,促进自噬相关蛋白表达上调。除此之外,DA-CH5还可部分恢复线粒体功能相关蛋白PGC-1α和NRF-1的表达水平。在提高细胞生存率,降低细胞活性氧簇水平,提高p-Badser136,p-AKTser473和NRF1表达水平这几个方面,DA-CH5较Exendin-4更具有优势。本研究将为临床治疗PD提供新的依据。第二部分:DA-CH5对6-OHDA诱导的SD大鼠模型神经毒性的保护机制研究目的:1.观察DA-CH5是否改善6-OHDA立体定位注射至单侧MBF诱导的SD大鼠模型的PD样行为学障碍,并揭示其神经保护作用机制。2.探究6-OHDA诱导的SD大鼠模型中,GLP-1/GIP双受体杂合肽DA-CH5相对于GLP-1受体激动剂Exendin-4是否更具有优势。方法:1.立体定位手术及实验分组:将大鼠麻醉固定于立体定位仪上,根据大鼠脑立体定位图谱定位,用颅骨钻在大鼠颅骨相应位置打眼,将5μL 6-OHDA溶液(2mg/m L)经微量注射器注入右侧内侧前脑侧束中(MBF)。大鼠自手术后每天一次分别腹腔注射Exendin-4,DA-CH5和等体积生理盐水持续30天,分为如下4组:(1)Sham+Saline组;(2)6-OHDA+Saline组;(3)6-OHDA+Exendin-4组;(4)6-OHDA+DA-CH5组。2.行为学检测:手术后第31天进行如下行为学实验:(1)旷场实验:将大鼠置于由长75 cm,高35 cm围墙组成的正方形旷场中自主运动10min,由动物运动分析系统记录大鼠运动的轨迹,并计算其累计运动距离。(2)阿扑吗啡诱导的转圈实验:腹腔注射0.05 mg/kg阿扑吗啡10 min后,将大鼠置于正方形旷场中自主运动30 min,由动物运动轨迹捕捉系统记录大鼠运动的轨迹。后经人工分析录像记录大鼠向立体定位手术对侧的转圈数。3.取材:将完成行为学实验的动物于手术后第32天处死。(1)每组取4只大鼠经生理盐水和4%多聚甲醛先后灌注后取脑,又经30%蔗糖溶液中脱水,作冰冻切片后用于免疫荧光染色。(2)每组取6只大鼠经生理盐水灌注后,分别摘取患侧中脑纹状体(用于Elisa检验)和黑质组织(用于Western blot检验)。4.Elisa法检测纹状体多巴胺和TNF-α浓度:将纹状体组织于装有RIPA裂解液(1mg/10μL)和蛋白酶抑制剂pmsf(1:100 RIPA裂解液)的匀浆器中研磨后裂解后,经离心后取上清液。再经BCA法测得其蛋白浓度后,用RIPA裂解液调平各个样品的蛋白浓度。随后依照多巴胺Elisa试剂盒与TNF-α试剂盒的说明书的具体步骤孵育上样(3复孔)。最后经酶标仪测其OD值并通过标准曲线计算多巴胺和TNF-α浓度。5.免疫荧光染色评价黑质区多巴胺神经元与纹状体星形胶质细胞数量:在玻片上的滴加10%山羊血清常温封闭30 min后,按照1:100的稀释比例滴加rabbit anti-TH antibody或rabbit anti-GFAP antibody于4℃过夜孵育。又经由荧光素标记的Goat Anti-Rabbit Ig G FITC conjugated secondary antibody于37℃孵育2h后,封片并使用荧光显微镜拍照观察。6.将黑质组织用Western blot检测如下蛋白表达:(1)酪氨酸羟化酶TH;(2)α突触核蛋白寡聚体;(3)炎性因子TNF-α、IL-β;(4)胰岛素信号通路蛋白以及线粒体功能相关蛋白p-IRS-1ser312、t-IRS-1、PGC-1α、NRF-1;(5)凋亡相关蛋白active-Caspase-3、Caspase-3、Bax、Bcl-2;(6)自噬相关蛋白SQSTM1、Beclin-1。并且用GAPDH或β-actin作为内参照。结果:1.行为学检测:(1)旷场实验:6-OHDA Saline组大鼠的移动距离相对于Sham Saline组有显著下降(P<0.001;vs.Sham Saline group)。相较于6-OHDA Saline组大鼠,6-OHDA+DA-CH5组大鼠显著恢复了运动能力,而6-OHDA+Exendin-4组大鼠(P<0.05;vs.6-OHDA Saline group)仅能观察到略有好转。(2)阿扑吗啡诱导的转圈实验:6-OHDA Saline组大鼠向损伤侧转圈数(P<0.001;vs.Sham Saline group)较Sham Saline组有显著上升。而6-OHDA+Exendin-4组(P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)和6-OHDA+DA-CH5组大鼠(P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)均有显著改善。而6-OHDA+DA-CH5组大鼠(P<0.05;vs.6-OHDA+Exeindin-4 group)又较6-OHDA+Exendin-4组略有改善。2.Elisa法检测:(1)6-OHDA Saline组大鼠纹状体内多巴胺含量(P<0.01;vs.Sham Saline group)相对于Sham Saline组有显著下降,而唯有经DA-CH5治疗过的大鼠(P<0.05;vs.6-OHDA Saline group)可恢复多巴胺水平。(2)6-OHDA Saline组大鼠纹状体内TNF-α含量(P<0.05;vs.Sham Saline group)相对于Sham Saline组略有上升,而经Exendin-4(P<0.05;vs.6-OHDA Saline group)和DA-CH5(P<0.05;vs.6-OHDA Saline group)治疗过的大鼠均可逆转该现象。3.免疫荧光染色:(1)6-OHDA Saline组大鼠黑质区由TH标记的多巴胺神经元数量(P<0.001;vs.Sham Saline group)相对于Sham Saline组显著减少,而经Exendin-4(P<0.01;vs.6-OHDA Saline group)和DA-CH5(P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)治疗过的大鼠均可逆转该现象。(2)6-OHDA Saline组大鼠纹状体由GFAP标记的星型胶质细胞数量(P<0.001;vs.Sham Saline group)相对于Sham Saline组显著增多,而经Exendin-4(P<0.05;vs.6-OHDA Saline group)和DA-CH5(P<0.01;vs.6-OHDA Saline group)治疗过的大鼠均可部分改善星型胶质细胞的异常增多。4.Western blot检验:(1)经6-OHDA诱导使得黑质区TH水平显著下降(P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)。而经过Exendin-4(P<0.001;vs.Sham Saline group)与DA-CH5(P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)治疗均可一定程度上改善该毒性损伤。(2)经6-OHDA诱导使得黑质区α突触核蛋白寡聚体水平异常升高(P<0.001;vs.Sham Saline group)。经过Exendin-4治疗(P<0.05;vs.6-OHDA Saline group)和DA-CH5(P<0.01;vs.6-OHDA Saline group)可有效抑制α突触核蛋白寡聚体表达上调。(3)经6-OHDA诱导使得黑质区炎症因子释放显著增多(TNF-α,P<0.001;IL-1β,P<0.001;vs.Sham Saline group)。经过Exendin-4治疗(TNF-α,P<0.05;IL-1β,P<0.05;vs.6-OHDA Saline group)仅可小幅改善该炎性反应,而DA-CH5(TNF-α,P<0.001;IL-1β,P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)可显著抑制炎症因子释放。其中,DA-CH5(P<0.05;vs.6-OHDA+Exendin-4 group)与Exendin-4组相比较,对释放IL-1β的抑制作用的差异具有统计学意义。(4)经6-OHDA诱导使得黑质区胰岛素底物p-IRS-1ser129的表达显著上调(P<0.001;vs.Sham Saline group),而该现象经过Exendin-4(P<0.05;vs.6-OHDA Saline group)和DA-CH5(P<0.01;vs.6-OHDA Saline group)治疗后均可得到小幅改善。此外Exendin-4(PGC-1α,P<0.05;NRF-1,P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)和DA-CH5(PGC-1α,P<0.05;NRF-1,P<0.01;vs.6-OHDA Saline group)均可有效缓解6-OHDA(PGC-1α,P<0.001;NRF-1,P<0.001;vs.Sham Saline group)诱导所致的线粒体功能相关蛋白PGC-1α和NRF-1表达失调。(5)经6-OHDA诱导使得黑质区active-Casepase-3的表达显著上调(P<0.001;vs.Sham Saline group),而该现象经过Exendin-4(P<0.01;vs.6-OHDA Saline group)和DA-CH5(P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)治疗后均可得到显著改善。同时,Exendin-4(Bax,P<0.05;Bcl-2,P<0.01;vs.6-OHDA Saline group)和DA-CH5(Bax,P<0.001;Bcl-2,P<0.001;vs.6-OHDA Saline group)均可有效缓解6-OHDA(Bax,P<0.001;Bcl-2,P<0.001;vs.Sham Saline group)诱导所致的凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达失调。此外,经DA-CH5(P<0.05;vs.6-OHDA+Exendin-4 group)治疗后的Bcl-2的表达水平较6-OHDA+Exendin-4组提升较为显著。(6)经Exendin-4(P<0.05;vs.Sham Saline group)和DA-CH5(P<0.01;vs.Sham Saline group)治疗后,均可小幅提升自噬相关蛋白Beclin-1表达水平。而只有DA-CH5(P<0.001;vs.Sham Saline group)显著提升了SQSTM1的表达水平,并且与Exendin-4相比差异具有统计学意义(P<0.01;vs.6-OHDA+Exendin-4 group)。结论:Exendin-4和DA-CH5可缓解6-OHDA诱导大鼠模型自主运动异常、黑质-纹状体多巴胺减少、炎症细胞因子释放。又调控了α-突触核蛋白、线粒体功能相关蛋白和凋亡相关蛋白的异常表达,并促进自噬相关蛋白表达上调。此外,改善动物PD样障碍,抑制炎症因子表释放,调控凋亡相关蛋白表达水平这几个方面,DA-CH5较Exendin-4略有优势。本研究为临床治疗PD提供新的依据。