背景:造血干细胞移植是治疗急性白血病的有效手段,自体造血干细胞移植具有适用范围广、费用较少、安全性高等优点,但是移植后患者的复发率较高。微小残留病(Minimal Residual Disease,MRD)清除不彻底是其根源。造血微环境对白血病的生长、支持、庇护是白血病残留的重要因素。基质细胞是造血微环境的主要成分,具有调控白血病细胞生长、浸润,介导白血病的残留及耐药的作用。间隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)是相邻细胞间普遍存在的直接通讯方式。间隙连接蛋白43(connexin43,CX43)介导的GJIC广泛存在于骨髓基质细胞、基质细胞与造血细胞之间,是骨髓基质参与造血调控的必要条件。GJIC减弱或缺失在实体肿瘤的发生发展中起着重要作用。我们前期对急性白血病患者的骨髓基质细胞进行检测发现,其CX43表达明显降低,GJIC功能也明显减弱,对白血病的阻抑作用减弱;临床研究发现,自体造血干细胞移植后患者的GJIC功能长时间处于较低水平,导致骨髓微环境对白血病的阻抑作用减弱,可能是残留白血病易复发的因素。人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCSCs)在体外对白血病细胞株具有抑制增殖及促进凋亡的作用,体内能归巢至骨髓修复造血微环境。能否利用人脐血源基质细胞这一基因载体和对白血病细胞具有阻抑作用的特性,将Cx43基因转染新型人脐血源基质细胞与自体造血干细胞联合移植给预处理后的微小残留病小鼠模型,起到重建移植后GJIC功能以净化小鼠微小残留病的作用,从而降低自体移植后白血病的复发是值得验证的科学设想。本课题为国家自然科学基金项目(No.81070388)“CX43修饰人脐血源基质细胞移植对自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation,AHSCT)后残留白血病净化效应及机制研究”的研究内容。试图从改造白血病造血微环境功能GJIC角度去影响白血病细胞的增殖、分化过程,从而达到去恶化的目的,为探寻白血病治疗的新方法,积累理论和实验依据奠定基础。目的:观察Cx43修饰的新型人脐血源基质细胞移植在造血干细胞移植后的微小残留白血病小鼠骨髓微环境的定植和对异常骨髓微环境的修复作用,通过修复和增强移植后小鼠骨髓基质GJIC功能,改善骨髓微环境造血调控功能,实现对小鼠残留白血病体内净化。方法:1.CX43重组腺病毒载体(Ad-Cx43-GFP)转染人脐血源基质细胞按本科室已经建立的方法对健康产妇脐带血进行细胞分离并贴壁培养,获得人脐血源基质细胞。按我科常规方法构建Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞。分别用免疫荧光法、PCR、Western-Blot、光脱色荧光恢复技术(fluorescence recovery after photo bleaching,FRAP)检测转染后Cx43表达。2.构建人脐血源基质细胞及L615细胞共培养体系,体外观察CX43转染前后人脐血源基质细胞对L615白血病细胞的调节作用实验分三组:1)阴性对照组:L615细胞单独培养;2)hUCSCs/L615组:人脐血源基质细胞与L615细胞共培养组3)Ad-Cx43-hUCSCs/L615组:Ad-Cx43-GFP转染的人脐血源基质细胞与L615细胞共培养组CCK8法检测共培养后L615细胞的生长曲线,对比各组间L615细胞增殖率;流式细胞术检测共培养后L615细胞的凋亡率及细胞周期;Western-Blot检测共培养后L615细胞caspase3、6、7表达情况。3.构建L615白血病MRD小鼠模型,进行人脐血源基质细胞联合自体造血干细胞移植,观察转染后人脐血源基质细胞对自体造血干细胞移植小鼠残留白血病的抑制效应将L615细胞经尾静脉注入L615同系小鼠,3天后经腹腔注射环磷酰胺200mg/kg,从而获得L615白血病MRD小鼠模型。实验分为两组:1)BM组:骨髓造血干细胞移植组2)Ad-Cx43-hUCSCs+BM组:Ad-Cx43-GFP转染的人脐血源基质细胞联合骨髓造血干细胞移植组以残留白血病L615为受体鼠,以正常L615为供鼠,受鼠在第0天接受6.0 Gy 60Coγ射线TBI;照射后6 h,经尾静脉注射来自供鼠的骨髓造血干细胞细胞以及CM-Dil标记的Cx43修饰的人脐血源基质细胞,其中,BM组输注骨髓细胞为2×106个/只、Ad-Cx43-hUCSCs+BM组输注骨髓细胞及人脐血源基质细胞各1×106个/只。对不同组小鼠移植后尾静脉血行血常规检查以观察造血重建情况;对不同组小鼠移植后的骨髓进行涂片及骨髓病理切片检查;利用荧光标记追踪Ad-Cx43-hUCSCs移植后体内分布情况;对移植后小鼠的骨髓基质细胞进行GJIC功能检测,于移植后不同时间点分别取肝脏、脾脏、肺、肾脏进行病理切片及HE染色;观察各组小鼠移植后的生存率。结果:1.成功构建Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞:转染后24h可见绿色荧光表达,48h荧光表达达到峰值,转染效率(89.30±3.12)%。免疫荧光、RT-PCR以及Western-Blot证实CX43基因修饰后的hUCSCs Cx43表达水平较未转染组显著升高(CX43mRNA升高2倍,CX43蛋白表达升高3倍)(p<0.05)。进一步检测GJIC功能,结果显示:Ad-Cx43-GFP组细胞在漂白后40s时的荧光与淬灭前水平基本相当,而对照组无法恢复。2.CX43基因修饰的人脐血源基质细胞对L615细胞的影响:1)以含20%胎牛血清的DMEM+PRMI1640混合培养基作为培养液,成功建立了两种细胞的体外接触共培养体系,共培养72h后,显微镜下可见基质细胞与L615细胞直接接触,电镜下能清晰的看到基质细胞粘附、包裹L615细胞。2)CCK8法检测细胞增殖:共培养48h,转染Cx43组L615细胞增殖受到明显抑制,直接测得OD值,Cx43转染组明显小于其余各组,两两间比较,Cx43转染组与另外两组差异均有统计学意义(p<0.05)。提示自共培养48h起,转染Cx43组L615细胞活力明显降低,存活率明显降低(p<0.05)。3)流式细胞仪检测细胞凋亡:转染CX43组L615细胞凋亡率为9.70±0.83%,明显高于未转染组(7.33±0.74%)和阴性对照组(2.50±0.85%),差异有显著性(p<0.05)。4)流式细胞仪检测细胞周期:Cx43转染组G0/G1期细胞比例约为80.43%,较阴性对照组(84.43%)降低(P<0.05);Cx43转染组S期细胞比例为10.42%,较阴性对照组(6.38%)升高(P<0.05)。G2/M期细胞比例Cx43转染组(8.52%)与单独培养组(8.15%)相似(P>0.05)。未转染组各细胞周期的比例与单独培养组无统计学差异。5)Western-Blot检测共培养后L615细胞caspase3、6、7表达:Cx43转染组caspase3表达较对照组升高1.8倍(P<0.05)。Cx43转染组caspase7表达较对照组升高7倍(P<0.05)。caspase6表达各组间无明显差异(P>0.05)。3.Ad-Cx43-hUCSCs对自体造血干细胞移植小鼠残留白血病的抑制效应:第0天以L615细胞经尾静脉注射L615同系小鼠致白血病,细胞量2×106个/只,于接种+5天即在外周血中查见白血病细胞,接种+8天骨髓、肝脏、脾脏均查见大量白血病细胞浸润,平均存活时间:11±1.71天。第3天经腹腔注射环磷酰胺,200mg/kg,化疗后+5天白细胞明显降低,化疗后+7天白细胞数开始回升,+17天接近正常,此时骨髓、肝脏、脾脏均未查见白血病细胞,于+23天疾病复发,平均存活时间27.33±2.49天。提示治疗后L615模型小鼠能达到完全缓解,存活时间延长,但体内仍有白血病残留,最后复发。1)Ad-Cx43-hUCSCs体内分布情况:移植后24小时即在小鼠骨髓、肝脏、脾脏、肺脏均能检测到Ad-Cx43-hUCSCs,移植+7天,骨髓、肝脏、脾脏中红色荧光细胞数量增加,荧光强度减弱,肺脏中红色荧光标记细胞减少。移植+14天,骨髓及其他脏器均不能查见红色荧光标记的细胞。2)移植小鼠血象变化情况:移植后,Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠白细胞从+8天开始、血小板从+11天开始回升速度明显快于BM组(P<0.05)比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3)FRAP检测两组小鼠骨髓基质细胞的GJIC功能:BM+Ad-Cx43-hUCSCs联合移植组,骨髓基质细胞的荧光强度在淬灭后5min内恢复69.33±1.25%,较BM单独移植组(51.67±1.7%)明显增高,有统计学意义(P<0.05)。4)人脐血源基质细胞移植骨髓涂片和病理切片的变化:移植+17天,骨髓涂片显示,Cx43+hUCBDSCs+BM组未查见白血病细胞浸润(p<0.05),BM组有大量白血病细胞浸润(图11)。骨髓活检显示:Cx43+hUCBDSCs+BM组未见白血病细胞,BM组骨小梁减少,细胞形态偏幼稚,成簇、成团分布(图12)。5)各组小鼠移植后28天内的生存率:Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠平均生存时间为26.9±1.52天,较BM组(23.70±1.99天)延长(p<0.05)Ad-Cx43-hUCSCs+BM组小鼠死亡率20%,较BM组35%降低(p<0.05)。结论:1.CX43基因腺病毒可成功转染hUCSCs,Ad-Cx43-hUCSCs的CX43表达水平上调,GJCI功能增加;2.成功建立人脐血源基质细胞及L615细胞共培养体系:Ad-Cx43-hUCSCs与L615细胞株共培养可抑制L615细胞增殖,上调L615细胞caspase3、7表达水平,促进其凋亡;3.Ad-Cx43-hUCSCs联合自体造血干细胞移植后,可归巢至骨髓、脾脏、肝脏、肺等器官;联合移植可促进小鼠造血重建;使骨髓基质细胞GJIC功能增强,有助于清除残留白血病,延长移植小鼠生存。