随着糖化学与糖生物学的发展,糖类药物研发已受到全世界科学家的广泛关注。但是真正临床用于治疗和诊断的糖类药物相比起小分子药物来说还是很少。造成这种现状的主要原因是聚糖精细结构解析和其靶向性作用机制研究十分困难。结构明确的聚糖与功能性蛋白的相互作用及其生物活性机制研究将有助于糖类药物的研发。肝素/硫酸乙酰肝素类的糖胺聚糖在生物体内具有广泛而重要的生理功能。因此我们期望通过研究与肝素一样带负电荷的岩藻聚糖硫酸酯和果胶类聚糖的结构和生物活性来阐明聚糖的靶向性生物功能作用机制,促进糖类药物的发展。海蕴是索藻目海蕴科植物海蕴(Nemacystus decipiens)的藻体。根据《本草拾遗》记载,海蕴“咸,寒,无毒”,并且有“主瘿瘤结气在喉间,下水”的功效。除了其药用功能外,海蕴还是一种被广泛食用的海藻。目前海蕴中大分子和小分子天然产物活性还没有文献报道。有两篇文献对海蕴多糖结构进行了初步的糖组成分析,海蕴多糖的精细结构还未见报道。海蕴属于褐藻,褐藻中主要的多糖有褐藻淀粉、褐藻胶和岩藻聚糖。为了明确海蕴中药效活性的物质基础,我们对海蕴多糖精细结构进行解析。首先我们用80℃热水对海蕴多糖进行提取,得到粗多糖NDH。红外光谱和糖组成分析表明NDH主要由硫酸化的岩藻聚糖组成。我们用强阴离子交换色谱QFF和凝胶渗透色谱S300对NDH多糖进行纯化,得到6个均一多糖,命名为NDH01,NDH221,NDH231,NDH241,NDH31和NDH41。我们着重对均一多糖NDH01进行结构解析。红外、核磁共振、糖组成分析、甲基化分析,部分酸水解分析实验结果表明NDH01是一种分子量为216 kD的高度分支的乙酰化的岩藻聚糖硫酸酯。NDH01由甘露糖(Man),葡萄糖醛酸(GlcA)和岩藻糖(Fuc)以3.0:14.4:82.6的比例组成,并且含有摩尔比例分别为34.3%和13.9%的硫酸基和乙酰基。NDH01的主链由α-D-1,2-Manp和β-D-1,4-GlcpA二糖重复单元构成。支链主要在1,2-Man的C3,C4和C6位。支链主要由1,3,4-Fuc,1,4-Fuc,1,3-Fuc和1,4-GlcA构成。有部分T-Fuc和硫酸基取代在1,3,4-fuc的c4位。生物活性数据表明ndh01多糖能够浓度依赖性的抑制人微血管内皮细胞(hmec-1)的管腔生成。hmec-1细胞划痕愈合实验表明ndh01可以通过显著抑制hmec-1细胞迁移来实现其抑制血管生成能力。分子生物学实验表明ndh01能够通过抑制smad1/5/8,erk和fak磷酸化来抑制hmec-1细胞管腔形成。此外,我们还发现ndh01能够抑制bmp4(bonemorphogeneticprotein4)和bmp2(bonemorphogeneticprotein2)的表达。通过表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,spr)实验,我们测定了ndh01与bmp2,bmp4之间的结合常数,kd值分别为8.93×10-6,4.06×10-8。ndh01与bmp2,bmp4的结合力很强,这表明ndh01多糖能够靶向bmp2和bmp4功能性蛋白,发挥其药理活性。进一步的基于岩藻聚糖结构的血管生成抑制剂研究表明,来源于海蕴的其它岩藻聚糖ndh221,ndh231,ndh241,ndh32和ndh41也能靶向bmp2,明显抑制hmec-1细胞的管腔形成能力。这些聚糖与bmp2的结合常数kd值分别为7.67×10-6,1.16×10-5,1.5×10-5,2.55×10-6。进一步的研究表明ndh221,ndh231,ndh241,ndh32和ndh41还能与bmp2的受体bmpr-ia,bmpr-ii相互作用。其中与bmpr-ia结合常数kd值分别为3.34×10-5,2.64×10-5,2.95×10-5,2.07×10-5,1.83×10-5。与bmpr-ii的结合常数kd值分别为3.13×10-5,2.70×10-5,2.15×10-5,9.33×10-6,7.67×10-6。细胞水平生物活性与岩藻聚糖和bmpr-ia,bmpr-ii相互作用的强度成正相关,这表明岩藻聚糖和bmpr-ia,bmpr-ii相互作用对抗血管生成活性的影响正相关性比海蕴多糖与bmp2相互作用的正相关性更明显。为了深入研究多糖靶向性结构基础,我们对聚糖-蛋白共晶进行探索研究。通过稀酸和h2o2/vc两种方法制备得到一系列的岩藻寡糖。并且同过大肠杆菌原核表达体系表达纯化得到复性的bmp2二聚体。通过试剂盒筛选晶体培养条件,我们已经初步找出bmp2晶体生长的缓冲液配方为peg(聚乙二醇)-异丙醇-mes(2-吗啉乙磺酸)体系,并得到了针状晶体。锁阳是锁阳科、锁阳属植物锁阳(cynomoriumsongaricumrupr.)的全草。根据《本草纲目》记载,锁阳具有“润燥养津,治痿弱”的功效。其活性物质基础研究表明其主要有三萜类、甾体、木脂素、生物碱、黄酮、皂苷类等小分子天然产物。但科学家对其大分子多糖的研究还较少。为了研究锁阳复杂酸性多糖的结构和功能,我们通过沸水对锁阳茎体进行提取,得到粗多糖CSW。运用DEAEcellulose阴离子交换凝胶色谱和S300凝胶色谱对CSW进一步分离纯化,得到分子量为75.8 kD的均一多糖CSW2S2。结合红外、核磁共振、糖组成分析、甲基化分析,部分酸水解分析,我们发现CSW2S2的主链主要由1,2-Rha和1,4-GalA二糖重复单元组成。阿拉伯聚糖侧链连接在1,2-Rha的C4位,主要由1,5-Ara组成,并且在1,5-Ara的C2和C3处有分支。另一种半乳聚糖侧链由1,4-Gal和1,6-Gal组成,1,6-Gal的C3位有分支。整个半乳聚糖侧链也连接在1,2-Rha的C4位。细胞水平活性评价表明锁阳多糖CSW2S2能够浓度依赖性的减少高糖诱导的INS-1E细胞凋亡。综上所述,本论文首次对海蕴多糖的结构,抗血管生成活性,靶向性和相关作用机制进行了较系统的研究。发现海蕴中岩藻聚糖结构的差异对其靶向BMP及其受体BMPR有明显影响,这些研究为基于岩藻聚糖抗肿瘤血管生成的创新药物研究奠定了良好基础。