胶原蛋白是广泛存在于所有动物体中一个重要的结构蛋白,约占人体总蛋白的1/3,占皮肤干重的3/4,是细胞质基质中最普遍的成分。胶原蛋白主要分布在动物的肌鞘、腱、软骨、韧带和皮肤中,它是韧带和肌腱的主要成份,具有很强的伸张能力,在细胞质基质中胶原蛋白起到支架作用。已经报道的胶原蛋白有28种不同类型,它们在动物体内的分布也有所不同。其中Ⅲ型胶原蛋白主要存在血管、皮肤和肠道中。胶原蛋白应用领域广泛,利用传统的胶原蛋白生产方法远远不能满足需求,从动物体中提取的胶原蛋白,可能存在病毒隐患；化学合成法周期长、成本较高；而利用生物技术方法制备胶原蛋白能克服以上困难。羟化酶是胶原蛋白合成中的关键酶,在维系胶原蛋白结构稳定起着重要作用。本实验利用毕赤酵母共表达人源Ⅲ型胶原蛋白及关键酶P4H,以期制备具有应用价值的Ⅲ型蛋白。本研究如下：利用优化的羟化酶基因构建P4H(脯氨酸羟化酶)表达载体,将其转化毕赤酵母X33,筛选出含有P4H的毕赤酵母重组菌株。优化Ⅲ型胶原蛋白基因,构建表达载体,电转化含有羟化酶的重组菌株,转化子诱导表达,72h后收菌,破碎细胞提取胞内蛋白,利用8%SDS-PAGE分析,并通过质谱确定Ⅲ型胶原蛋白分子量大小,得到目的蛋白大小为150kDa,经胃蛋白酶水解后的蛋白大小为120kDa。筛选得到的产胶原蛋白菌株通过摇瓶发酵条件优化,在此基础上通过高密度发酵后提高蛋白表达量,最后获得产量较高的胶原蛋白。尝试用不同的方法分离纯化胶原蛋白,盐析、分子筛、离子交换等,最后发现盐析的方法得到高纯度的胶原蛋白。蛋白性质鉴定：首先利用质谱分析胶原蛋白的羟基化水平；其次,以标准蛋白作对照,分析胶原蛋白的三股螺旋结构；同时,利用非还原胶检测目的蛋白形成三聚体的特性；最后通过扫描电镜观察,确定胶原蛋白形成胶原纤维。以上性质均与标准Ⅲ型胶原蛋白的特征相符。