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目的:
RNA修饰作为与DNA和组蛋白修饰类似的表观遗传学调节方式,具有非常重要的研究意义。迄今为止,已经100多种RNA修饰被确定,其中,m6A是最常见也最重要的。研究表明,m6A修饰在前mRNA剪接,3末端加工,mRNA的核输出,翻译调控和衰变中都起着关键作用,因此m6A的检测对表观遗传学研究具有非常重要的意义。此外,RNA甲基化表达的失调与各种癌症密切相关。RNA甲基化可以影响癌症干细胞的分化、癌细胞增殖、迁移和肿瘤转移,同时,还可能有助于肿瘤免疫,所以m6A的检测对临床研究也具有重要意义。
目前,m6A-RNA的检测主要依赖于m6A特异性甲基化免疫沉淀和高通量测序的方法,这些方法具有较高的准确性,但操作较为复杂。因此,建立一种对m6A-RNA快速、高选择性、简便的检测方法对m6A的研究具有重要意义。
本研究首先合成了多孔的PtCo纳米材料,并制备类修饰的DNA-PtCo纳米探针。然后将抗m6A抗体和纳米探针相结合,构建了用于m6ARNA检测的电化学生物传感器,并对重要参数进行优化。最后,对该传感器的性能进行评估。
方法:
本研究利用抗m6A抗体作为识别元件,类修饰的DNA-PtCo纳米探针作为信号输出元件,构建了一种用于RNA甲基化检测的,快速、高选择性的电化学生物传感器。首先,采用一步法合成多孔的PtCo纳米材料,并修饰上类修饰的DNA链,制备类修饰DNA-PtCo纳米探针。然后将抗m6A抗体修饰到金电极表面,并用BSA对非特异性结合位点进行封闭。修饰到电极表面的抗体既可以捕获类修饰的DNA-PtCo纳米探针,又可以识别m6A-RNA,因此,目标物与纳米探针竞争结合电极表面的抗体,结合到电极表面的探针数量与目标物浓度相关。通过检测结合到电极上的纳米探针所产生的DPV信号,可以实现目标物m6A-RNA的定量检测。
结果:
在最优的实验条件下,本研究构建的电化学生物传感器具有较好的特异性和灵敏度。该传感器的线性范围为0.005-100nM,最低检测限为2.1pM,检测时间<1.5小时。此外,构建的传感器成功实现对L02、Huh7和HepG-2细胞中实际提取的总RNA样本中m6A的检测,且与m6A检测试剂盒检测结果一致。
结论:
本研究利用抗m6A抗体既能识别m6A修饰的RNA又能识别m6A修饰的DNA的特点,以及DNA比RNA性质更为稳定的优点,设计了类修饰的DNA-PtCo纳米探针。该纳米探针一方面与目标物形成竞争关系,实现信号的转化,另一方面利用PtCo多孔纳米材料优秀的催化性能,实现信号的放大,使构建的传感器具有较好的灵敏度。在最优的条件下,该传感器具有较高的特异性和灵敏度,对实际提取的样本也具有良好的检测性能。该方法在m6A的检测上具有应用潜能,对进一步生物相关功能的研究具有推动作用。
RNA修饰作为与DNA和组蛋白修饰类似的表观遗传学调节方式,具有非常重要的研究意义。迄今为止,已经100多种RNA修饰被确定,其中,m6A是最常见也最重要的。研究表明,m6A修饰在前mRNA剪接,3末端加工,mRNA的核输出,翻译调控和衰变中都起着关键作用,因此m6A的检测对表观遗传学研究具有非常重要的意义。此外,RNA甲基化表达的失调与各种癌症密切相关。RNA甲基化可以影响癌症干细胞的分化、癌细胞增殖、迁移和肿瘤转移,同时,还可能有助于肿瘤免疫,所以m6A的检测对临床研究也具有重要意义。
目前,m6A-RNA的检测主要依赖于m6A特异性甲基化免疫沉淀和高通量测序的方法,这些方法具有较高的准确性,但操作较为复杂。因此,建立一种对m6A-RNA快速、高选择性、简便的检测方法对m6A的研究具有重要意义。
本研究首先合成了多孔的PtCo纳米材料,并制备类修饰的DNA-PtCo纳米探针。然后将抗m6A抗体和纳米探针相结合,构建了用于m6ARNA检测的电化学生物传感器,并对重要参数进行优化。最后,对该传感器的性能进行评估。
方法:
本研究利用抗m6A抗体作为识别元件,类修饰的DNA-PtCo纳米探针作为信号输出元件,构建了一种用于RNA甲基化检测的,快速、高选择性的电化学生物传感器。首先,采用一步法合成多孔的PtCo纳米材料,并修饰上类修饰的DNA链,制备类修饰DNA-PtCo纳米探针。然后将抗m6A抗体修饰到金电极表面,并用BSA对非特异性结合位点进行封闭。修饰到电极表面的抗体既可以捕获类修饰的DNA-PtCo纳米探针,又可以识别m6A-RNA,因此,目标物与纳米探针竞争结合电极表面的抗体,结合到电极表面的探针数量与目标物浓度相关。通过检测结合到电极上的纳米探针所产生的DPV信号,可以实现目标物m6A-RNA的定量检测。
结果:
在最优的实验条件下,本研究构建的电化学生物传感器具有较好的特异性和灵敏度。该传感器的线性范围为0.005-100nM,最低检测限为2.1pM,检测时间<1.5小时。此外,构建的传感器成功实现对L02、Huh7和HepG-2细胞中实际提取的总RNA样本中m6A的检测,且与m6A检测试剂盒检测结果一致。
结论:
本研究利用抗m6A抗体既能识别m6A修饰的RNA又能识别m6A修饰的DNA的特点,以及DNA比RNA性质更为稳定的优点,设计了类修饰的DNA-PtCo纳米探针。该纳米探针一方面与目标物形成竞争关系,实现信号的转化,另一方面利用PtCo多孔纳米材料优秀的催化性能,实现信号的放大,使构建的传感器具有较好的灵敏度。在最优的条件下,该传感器具有较高的特异性和灵敏度,对实际提取的样本也具有良好的检测性能。该方法在m6A的检测上具有应用潜能,对进一步生物相关功能的研究具有推动作用。