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背景: 在急性炎症或者全身炎性反应时，肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNFα)的表达升高伴随着组织器官上皮完整性的破坏，进而导致间隙增大，通透性增加，蛋白和液体渗漏，严重时引起器官功能障碍。在细胞水平，肿瘤坏死因子α可以使E-钙黏蛋白表达下降。E-钙黏蛋白的下调或缺失，降低细胞与细胞之间粘附的程度，进而导致上皮细胞的通透性和细胞活动性的增加。深入了解E-钙黏蛋白调节的分子机制，有助于提高对上皮屏障功能障碍引起的疾病的认识。肿瘤坏死因子受体相关因子2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor2，TRAF2)是一种重要的接头蛋白，参与肿瘤坏死因子α介导的信号级联反应，并发挥重要作用。TRAF2在肿瘤坏死因子α的刺激后能够募集到TNFR1或者TNFR2，调节NF-κB和c-Jun N terminal kinase(JNK)信号级联反应的激活。JNK参与调节E-钙黏蛋白介导的细胞粘附连接已经被报道，但是TRAF2是否参与调节E-钙黏蛋白的表达尚无阐述。研究表明，泛素化修饰参与调节TRAF2的活性，但是哪种去泛素化酶能够调节TRAF2蛋白稳定性还需探索。最近有研究表明，去泛素化酶USP48，也称做USP31，能够与TRAF2蛋白相互结合，但是否影响TRAF2蛋白的活性和稳定性还尚无论证。目前USP48的生理功能还不是很明确，但其广泛表达于各种组织器官中，提示可能参与多种必需的去泛素化过程。因此本课题拟深入研究去泛素化酶USP48和TRAF2结合的生理意义及其是否影响下游信号转导通路。 方法: 1.通过免疫印迹法明确US48对TRAF2蛋白水平的影响;通过实时荧光定量PCR检测USP48对TRAF2mRNA水平的影响。 2.通过细胞内泛素分析检测USP48对TRAF2泛素化的影响;通过免疫共沉淀明确USP48和TRAF2的相互结合;通过免疫染色明确USP48和TRAF2的细胞内定位。 3.通过免疫沉淀反应检测TNFα和GSK3β使USP48发生磷酸化;通过免疫共沉淀明确USP48和GSK3β的相互结合;通过免疫染色明确USP48和GSK3β的细胞内定位。 4.通过免疫印迹法明确GSK3β对TRAF2蛋白水平表达的影响;通过细胞内泛素分析检测GSK3β对TRAF2泛素化的影响。 5.通过体外合成系统合成重组的USP48野生型和突变型蛋白;通过体外去泛素化酶活性分析试剂盒检测USP48对K-48多聚泛素链的水解能力。 6.通过免疫印迹法明确USP48、JNK、TNIK对E-钙黏蛋白蛋白水平的影响;通过实时荧光定量PCR检测USP48、JNK、TNIK对E-钙黏蛋白mRNA水平的影响。 7.通过细胞-基质电阻抗测量技术检测USP48、JNK、TNIK对跨上皮细胞电阻抗值的影响。 结果: 1.USP48能够使TRAF2蛋白稳定。 1)通过转染SiRNA敲降USP48或转染USP48C98S-V5质粒抑制USP48催化活性可明显减少TRAF2蛋白水平; 2)敲降USP48对TRAF2mRNA水平无影响; 3)过表达USP48延长TRAP2蛋白的半衰期。 2.USP48去泛素化TRAF2发生在细胞质。 1)通过转染USP48-V5质粒过表达USP48能够减少TRAF2蛋白的泛素化水平; 2)抑制USP48活性增加TRAF2蛋白的泛素化水平; 3)敲降USP48增加TRAF2蛋白K-48位点的多聚泛素化水平; 4)USP48和TRAF2在细胞质中有共同定位。 3.GSK3β调节TNFα介导的USP48磷酸化。 1)TNFα和GSK3β可以使USP48发生磷酸化; 2)USP48结构域内含有GSK3β的磷酸化区域; 3)抑制GSK3β能够抑制TNFα介导的USP48磷酸化; 4)USP48和GSK3β在细胞质有共同定位。 4.USP48磷酸化有利于TRAF2蛋白稳定。 1)抑制GSK3β促进TRAF2蛋白降解; 2)抑制GSK3β促进TRAF2蛋白泛素化; 3)过表达GSK3βS9A减弱TRAF2蛋白泛素化; 4)过表达USP48磷酸化位点失活质粒降低TRAF2蛋白稳定性; 5)过表达USP48磷酸化位点失活质粒增加TRAF2蛋白泛素化。 5.GSK3β磷酸化USP48增强其去泛素化酶活性。 1)抑制GSK3β或过表达USP48磷酸化位点失活质粒对TRAF2和USP48之间相互结合无影响; 2)抑制GSK3β削弱USP48去泛素化TRAF2; 3)USP48磷酸化位点失活导致其去泛素化酶活性降低; 4)GSK3βS9A增强USP48去泛素化酶活性。 6.敲降USP48削弱TRAF2介导JNK1激活，进而增加E-钙黏蛋白表达。 1)敲降USP48削弱TNFα介导的JNK1和c-Jun的磷酸化; 2)敲降USP48增加E-钙黏蛋白表达; 3)抑制JNK削弱TNFα使E-钙黏蛋白表达下调; 4)抑制TNIK削弱TNFα使E-钙黏蛋白表达下调; 5)敲降USP48削弱TNFα使E-钙黏蛋白表达下调; 6)敲降USP48增加E-钙黏蛋白mRNA水平; 7)抑制JNK或TNIK增加E-钙黏蛋白mRNA水平。 7.敲降USP48或抑制JNK或TNIK增加上皮屏障完整性。 1)敲降USP48增加跨上皮细胞电阻抗值; 2)抑制JNK或TNIK增加跨上皮细胞电阻抗值; 3)敲降USP48促进LPA使跨上皮细胞电阻抗值升高。 结论: 1.GSK3β磷酸化USP48增强其去泛素酶活性，有利于使TRAF2蛋白更稳定，促进TNFα使JNK激活; 2.下调USP48仅影响TNFα使JNK激活，对TNFα使NF-κB激活无影响; 3.抑制JNK或TNIK能增加E-钙黏蛋白表达和上皮屏障完整性。 4.下调USP48通过影响JNK，能够增加E-钙黏蛋白表达和上皮屏障完整性。