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脂肪酶可以催化水解、酯化和转酯反应,作为生物制药和保健品加工等工业生产的一类重要工业酶类。其中,参与手性药物或药物中间体拆分和多不饱和脂肪酸富集反应的脂肪酶存在一些不足,如种类有限,对映体选择性或脂肪酸特异性差,酶活低,酶活易丧失,对高温、酸、高盐、有机溶剂等的耐受性弱,回收难,稳定性差,重复使用性差等。包括商品化脂肪酶在内的已被报道的脂肪酶远不能满足上述工业的急需。因此,手性化合物拆分和动植物油源中多不饱和脂肪酸的富集需要具有特定性质的脂肪酶。然而,在众多来源的脂肪酶中,具有较高酶活、较好稳定性和较高耐受性的细菌脂肪酶在水相或有机相中拥有较好的催化性能。此外,由于极端环境的特殊性,生存在其中的细菌所产脂肪酶就有可能具有一些特殊性质。因此,从极端环境的细菌中寻找脂肪酶,并在充分研究其酶学性质的基础上,加以工业应用探索,特别是在生物制药领域的应用探索,具有重要理论和实践意义。本研究拟以油污土样、油盐渍土样、深海泥样、北极冰川退缩后裸露矿区土样和新疆干旱地区土样等多种极端环境样品为研究对象,运用琼脂平板法、降落PCR、基因组步移、蛋白质纯化和共价固定等技术挖掘上述极端环境细菌脂肪酶资源,以期获得若干具有特殊性质和较好耐受性、且具有生物制药、保健等工业应用前景的新型细菌脂肪酶。主要研究如下。1.采用3种橄榄油平板,筛选到8株产脂肪酶菌株,其中菌株TY1-DH、TY4-BXN、TY4-HX和TY5-SH源于江西油脂加工作坊油污染土样,菌株11E105来自南海深海泥样,菌株R0-14源自Midre Lovénbreen冰川退缩后裸露矿区土样,菌株M9来自新疆干旱地区土样,菌株SL-4来源于马鞍山森林公园烧烤区油盐渍土样。经16S rRNA序列分析比对,它们分别属于Pseudomonas、Acinetobacter、Sphingomonas、Burkholderia和Psychrobacter属成员,分别命名为P.mendocina TY1-DH、A.lwoffii TY4-BXN、S.paucimobilis TY4-HX、B.cepacia TY5-SH、P.pacificensis 11E105、Pseudomonas sp.R0-14、P.moraviensis M9和B.ubonensis SL-4。这些菌株丰富了产脂肪酶菌种库。此外,由于来自由变暖引起冰川退缩而裸露矿区土样的Pseudomonas sp.R0-14具有一定特殊性,同时目前关于P.moraviensis和B.ubonensis的脂肪酶未见有报道,因此在被筛选出的产脂肪酶菌株中,它们所产的脂肪酶或许在生物制药领域中的研究价值更大。2.通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶层析纯化获得B.ubonensis SL-4的脂肪酶SL-4,根据蛋白质序列设计引物成功克隆其基因SL-4。序列比对显示,脂肪酶SL-4与来自B.ambifaria YCJ01的脂肪酶YCJ01、B.ceapcia S31的脂肪酶S31、B.cepacia的脂肪酶BCL的同源性均为88%,与B.cepacia ATCC 25416的脂肪酶LipA的同源性为86%,与Burkholderia sp.HY-10的脂肪酶LipA的同源性为81%。进化树分析显示,脂肪酶SL-4为I.2亚家族脂肪酶成员。酶学性质研究表明,SL-4对最适底物对硝基苯酚豆蔻酸酯的Km、kcat和kcat/Km值分别为0.72 mM、391.63 s-1和543.93s-1 mM-1,其最适pH为8.5,最适温度为65°C。在65°C条件下处理12 h,SL-4仍能保持60%以上的残余酶活,且在50°C条件下处理24 h,其残余酶活为90%以上,具有强热稳定性。在50°C、pH 8.5条件下,4 M NaCl处理24 h,SL-4仍能保持50%以上的残余酶活,具有较强的耐盐性。此外,它还具有强非离子型表面活性剂和有机溶剂耐受性。以Fe3O4磁性纳米颗粒成功固定脂肪酶SL-4,最优条件下的固定化率为94.45%,转酯酶活为385,066.8 U/min/g protein。固定化脂肪酶SL-4特异拆分(R,S)-1-苯乙醇,最优条件下其转化率和ees值分别为49.54%和99.90%;反应10个批次后,其转化率和ees值仍分别保持46.11%和84.93%,说明具有较好的重复操作稳定性。上述研究表明,脂肪酶SL-4在生物制药及有机合成等行业拥有良好应用前景。3.利用降落PCR和基因组步移技术获取了Pseudomonas sp.R0-14的脂肪酶基因lipR。该基因编码562个氨基酸,拥有Ser153-Asp202-His260催化三联体和103-113位残基组成的α-螺旋盖子。进化树分析显示,LipR为I.3亚家族脂肪酶成员。通过异源表达、尿素变性、透析复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度较高的重组脂肪酶LipR。酶学性质研究表明,LipR的最适温度为60oC,并在0-100°C间均保持一定活性,是一种广温性脂肪酶,最适pH为8.5,且其最适底物对硝基苯酚丁酸酯的Km和kcat值分别为0.37 mM和6.42 s-1。热稳定性研究表明,在50°C下处理12 h,LipR仍有90%以上残余酶活,具有较强热稳定性。它对乙腈、异丙醇、丙酮、甲醇和叔丁醇表现出较强耐受性。此外,LipR能使藻油中的多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸从原含量的0.74%富集到1.22%、二十二碳五烯酸从10.41%富集到21.24%、二十二碳六烯酸从27.79%富集到36.98%。初步表明LipR是广温性脂肪酶,且具有较好的工业应用前景,尤其是在保健品、医药、食品等选择性水解相关的研究领域。4.同样利用降落PCR和基因组步移技术获取了P.moraviensis M9的脂肪酶基因lipM。序列比对显示,LipM与来自P.mandelii JR-1的脂肪酶LipT、Pseudomonas sp.R0-14的脂肪酶LipR、Pseudomonas sp.MIS38的脂肪酶PML和Pseudomonas sp.CR-611的脂肪酶Lip I.3的同源性分别为82%、82%、54%和54%。进化树分析显示,LipM亦为I.3亚家族脂肪酶成员。通过异源表达、盐酸胍变性、透析复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度较高的重组脂肪酶LipM。酶学性质分析表明,LipM具有对硝基苯酚辛酸酯偏好性(Km:0.36 mM;kcat:35.7 s-1;kcat/Km:99.17 s-1 mM-1),其最适pH为8.0,最适反应温度为65°C,并在10-95°C间均保持一定活性,是一种广温性脂肪酶。热稳定性研究表明,LipM于65°C下处理12 h后仍有90%以上残余酶活,体现很强的热稳定性。此外,LipM具有甲醇、乙醇和异丙醇的中等强度耐受性。LipM亦能使藻油中EPA的相对含量从0.74%增加到1.25%、DPA从10.41%增加到17.61%、DHA从27.79%增加到47.02%,使它们的相对总含量达到65.88%;同时藻油中的甘油二酯含量达30.73%。上述特性表明,LipM是少有的广温性脂肪酶,其与LipR类似,可在保健品、医药、食品等广泛行业具有潜在应用价值。