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红厚壳素是一种来源于胡桐的香豆素化合物,它对引起艾滋病的HIV-1病毒具有强烈的抑制作用。调查结果表明,胡桐植物资源并不丰富,仅分布在海南岛东部的琼山至万宁一带,多数散生,小有连片分布。由此说明了通过植物细胞培养开发胡桐中抗HIV红厚壳素化合物的积极意义。 GC-MS分离出40种胡桐叶的挥发性成分,主要是醇类和高级烷烃化合物。以Inophyllum B为标准品,建立了检测红厚壳素的HPLC方法。 在MS培养基上,胡桐幼苗的叶、茎段与胚根均可诱导出愈伤组织,其中以茎段的诱导率最高达95.6%,而胚乳难以诱导愈伤组织。胡桐愈伤组织生长与培养基中无机盐含量有关,在B5、MS、White三种不同的基本培养中,以B5最适于胡桐愈伤组织的诱导,MS次之,White最差。1200lx全天光照可使茎段外植体的诱愈率达100%,对愈伤组织生长最佳。2,4-D/6-BA以6/1~4/1的比例有利于胡桐愈伤组织的生长。 比较不同外植体诱导的愈伤组织的生长量与红厚壳素含量,筛选出高产愈伤组织系CR2,红厚壳素含量为1.480mg/gDW。通过二次正交旋转组合设计,获得适于CR2愈伤组织系生长的优化培养基Mo(附加2,4-D2.0mg/L、6-BA0.32mg/L、蔗糖35g/L的B5培养基)。 在Mo培养基中,胡桐CR2悬浮培养细胞的生长过程曲线及培养体系中红厚壳素积累曲线均呈S型,整个生长过程均经历了5个主要阶段:迟滞期、指数生长期、线性生长期、稳定期、衰退期。迟滞期较长,生物量及红厚壳素产量达峰值的时间分别为培养21d和24d。不同起始蔗糖浓度、不同NH4+/NO3-比例及氮源总量对CR2悬浮培养细胞生长及红厚壳素的生物合成均有明显影响,3.5%的蔗糖、2/25的NH4+/NO3-比、27mmol/L的总氮量有利于CR2悬浮培养细胞的生长及培养体系中红厚壳素的合成。CR2细胞悬浮培养过程中,培养基中红厚壳素含量在细胞生长稳定期末期迅速增长,而细胞内红厚壳素含量变化不大。 从胡桐叶斑病的病组织中分离到壳多孢菌(Stagonospora curtisii(Berk.)Sacc)S-I菌株对胡桐CR2细胞合成红厚壳素具有诱导作用,最佳浓度为60mgGE/L。真菌刺激剂诱导培养过程中,细胞内红厚壳素含量变化不大,而培养液中红厚壳素含量在整个培养周期中一直呈线性增长。CR2细胞不同的生长阶段加入真菌刺激剂对红厚壳素的合成有显著影响。细胞生长18d加入真菌刺激剂诱导培养3d,使红厚壳素总量达59.174mg/L,较对照提高27%。 研究了CR2细胞悬浮培养过程苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的变化与红厚壳素积累动力学过程的关系。CR2细胞悬浮培养过程中,PAL活性的上升随后带来红厚壳素产量的增加,两者存在正相关性。真菌刺激剂加入,PAL活性出现不同