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腹腔镜手术以其损伤和痛苦小、并发症少、住院时间短等优点越来越多地应用于恶性肿瘤的治疗。但是,近年来文献却不断出现腹腔镜术后发生肿瘤穿刺孔转移(port-site tumor metastasis, PSM)及腹腔内肿瘤播散的病例报道。国内外学者们进行了多项相关实验,提示腹腔镜术后发生肿瘤穿刺孔转移及腹腔内播散是多因素参与的结果,比如穿刺孔部位的组织损伤,CO2沿戳卡的泄漏,肿瘤细胞的气雾化,气腹介质的选择和免疫功能的改变等,而腹腔镜手术中所通常使用的CO2气腹可能是促进肿瘤细胞生长和播散的最重要的因素。在妇科恶性肿瘤领域,已有研究发现CO2气腹能促进卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞的体外生长和转移,且与CO2气腹促使某些基因的表达发生改变有关。宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤,妇科恶性肿瘤领域里腹腔镜也更多地应用于宫颈癌的根治术,但迄今为止,国内外尚未见腹腔镜CO2气腹对宫颈癌细胞生长的影响及其机制的相关报道。本研究拟通过建立CO2气腹体外模型,观察CO2气腹对人宫颈癌CaSki细胞体外生长的影响并探讨其相关机制,为评估腹腔镜CO2气腹应用于宫颈癌治疗的安全性提出实验室依据。第一部分腹腔镜CO2气腹体外模型的建立[目的]建立一个理想的CO2气腹体外模型并评价其效果。[方法]采用不锈钢密封罐和自动气腹机建立CO2气腹体外模型,用MTT法观察CO2气腹(7mmHg, 4h)对人宫颈癌CaSki细胞体外生长的影响。实验重复三次。设未处理组为对照。[结果] CO2气腹组和对照组同次处理的组间比较结果显示,处理后第1~2d两组吸光度值无明显差异(P>0.05),处理后第3～5d CO2气腹组各时间点吸光度值明显高于对照组(P<0.05)。两组组内三次重复实验同一时间点所测吸光度值(A)无显著差异(P>0.05)。[结论]采用密封罐和自动气腹机所建立的CO2气腹体外模型是进行腹腔镜体外研究的一种理想模型;采用该模型发现CO2气腹可促进人宫颈癌CaSki细胞的体外生长。第二部分腹腔镜CO2气腹对人宫颈癌CaSki细胞体外生长的影响[目的]探讨CO2气腹对人宫颈癌CaSki细胞体外生长的影响。[方法]采用第一部分所建立的体外模型对CaSki细胞进行CO2气腹处理,处理压力为:0mmHg、7mmHg、14mmHg,处理时间为:1h,2h,3h,4h,以未处理组为对照组。通过采用MTT法描绘各组细胞生长曲线,流式细胞仪测定各组细胞周期分布情况并计算细胞增殖指数(PI),透视电镜观察细胞超微结构改变等指标观察不同压力的CO2气腹持续不同时间对人宫颈癌CaSki细胞体外生长的影响。[结果]1.析因设计的方差分析结果显示,CO2气腹处理压力和时间均为CaSki细胞生长的影响因素,且两者有交互作用。2.各处理组生长曲线的比较:2.1比较同一压力状态各处理时间组的生长曲线:当CO2气腹处理压力为0mmHg时,仅在处理4h时对CaSki细胞的增殖有短暂的促进作用。当压力为7mmHg时,CO2气腹处理2～4h均可促进CaSki细胞的体外生长。当气腹压力为14mmHg时,CO2气腹处理3～4h可促进CaSki细胞的体外生长。2.2比较同一处理时间时各压力组的生长曲线:当处理时间为1h时,CaSki细胞的生长不受处理压力的影响;当处理时间为2h时,仅7mmHg组在处理后第4～5d表现出促CaSki细胞生长的趋势;当处理时间持续3h时,7mmHg和14mmHg的气腹压力均促进CaSki细胞的体外生长,但7mmHg组促细胞生长的效应比14mmHg组强;当处理时间持续4h时,各压力组均可促进CaSki细胞的体外生长,0mmHg组只在第3d有短暂的促细胞生长效应,7mmHg组促细胞生长的效应最强。3.各处理组细胞周期分布的比较:当处理时间为1～2h时,各压力组间G0-G1期和S期细胞比例无显著差异(P>0.05);7mmHg和14mmHg组两组间G2-M期细胞比例无显著差异(P>0.05),但均明显高于0mmHg组和对照组(P<0.05)。当处理时间为3～4h时,7mmHg和14mmHg组G0-G1期细胞比例明显低于0mmHg组和对照组(P<0.05),以14mmHg组最低;14mmHg组S期细胞比例明显高于其余各组(P<0.05);7mmHg组和14mmHg组G2-M期的细胞比例明显高于0mmHg组和对照组(P<0.05),以7mmHg最高。表明7mmHg CO2气腹主要增加G2-M期细胞比例,而14mmHg CO2气腹主要增加S期细胞比例。4.各处理组细胞增殖指数(PI)的比较:当处理时间为1～2h时,各压力组细胞的增殖指数与对照组相比较均无显著差异(P>0.05);当处理时间为3～4h时,随着CO2气腹压力的增高细胞的增殖指数呈上升趋势,7mmHg和14mmHg组CaSki细胞的增殖指数均明显高于0mmHg组和对照组(P<0.05)。表明CaSki细胞的增殖指数与一定的压力和时间成正相关。5.各处理组电镜下超微结构的改变:对照组和0mmHg组电镜下均见肿瘤细胞的一般特征:核大,畸形,核仁明显,多个核仁边集。胞核以常染色质为主,胞浆游离核糖体丰富,微绒毛长。7mmHg和14mmHg组均可见明显异常核分裂像。[结论]在一定的压力和作用时间范围,CO2气腹促进人宫颈癌CaSki细胞的体外生长。第三部分腹腔镜CO2气腹促人宫颈癌CaSki细胞体外生长的机制探讨[目的]探讨腹腔镜CO2气腹促进人宫颈癌CaSki细胞体外生长的机制。[方法]采用第一部分所建立的体外模型对CaSki细胞进行CO2气腹处理,处理压力为:0mmHg、7mmHg、14mmHg,处理时间为:1h,2h,3h,4h,以未处理组为对照组。采用RT-PCR法检测CO2气腹处理后CaSki细胞中Survivin和Caspase-3 mRNA的表达变化;采用Western blot法检测CO2气腹处理后CaSki细胞中Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达变化;采用免疫细胞化学法检测CO2气腹处理后CaSki细胞中Survivin、Bcl-2、Caspase-3及PCNA和Ki-67的表达变化。[结果]1.析因设计的方差分析结果显示,CO2气腹压力和作用时间对CaSki细胞中Survivin、Bcl-2、Capase-3、PCNA和Ki-67的表达均有影响,且两者有交互作用。2.免疫细胞化学SP法显示:Survivin、Bcl-2、Capase-3主要表达于细胞浆,PCNA、Ki-67主要表达于细胞核。3. Survivin的表达变化:CO2气腹0mmHg和14mmHg处理1～2h时其Survivin的表达量与对照组相比无显著差异(P>0.05),其余各组Survivin的表达量均明显高于对照组(P<0.05)。在相同压力状态下,3~4h组Survivin的表达均明显高于1~2h组(P<0.05)。CO2气腹维持相同时间时,三个压力梯度中,总是以7mmHg组Survivin的表达最高,明显高于0mmHg、14mmHg和对照组(P<0.05)。0mmHg组和14mmHg组Survivin的表达无显著差异(P>0.05)。4. Bcl-2的表达变化:CO2气腹0mmHg组和14mmHg处理1～2h时Bcl-2的表达与对照组相比较均无显著差异(P>0.05),其余各组Bcl-2的表达均明显高于对照组(P<0.05)。当压力为7mmHg或14mmHg时,3~4h组Bcl-2的表达量明显高于1～2h组(P<0.05)。当CO2气腹维持相同时间时,总是以7mmHg组Bcl-2的表达最高,明显高于0mmHg、14mmHg和对照组(P<0.05)。当CO2气腹维持1~2h时,14mmHg和0mmHg组两组间Bcl-2的表达无显著差异(P>0.05)。当CO2气腹维持3~4h时,14mmHg组Bcl-2的表达明显高于0mmHg组和对照组(P<0.05)。5. Capase-3的表达变化:CO2气腹0mmHg组Capase-3的表达与对照组相比较无显著差异(P>0.05),而7mmHg和14mmHg组Capase-3的表达均明显低于0mmHg组和对照组(P<0.05)。CO2气腹处理相同时间时,7mmHg和14mmHg组两组间Caspase-3的表达无显著差异(P>0.05)。当压力为0mmHg时,Caspase-3的表达随着作用时间的延长无明显变化(P>0.05)。当压力为7mmHg或14mmHg时,1～3h各时间组Caspase-3的表达无明显差异(P>0.05),但4h组Caspase-3的表达明显低于1～3h组(P<0.05)。6. PCNA的表达变化:CO2气腹0mmHg组PCNA蛋白的表达与对照组相比较无显著差异(P>0.05),7mmHg和14mmHg组PCNA蛋白的表达均明显高于0mmHg组和对照组(P<0.05),以14mmHg组PCNA表达最高。此外,0mmHg和7mmHg组PCNA的表达不受处理时间的影响(P>0.05),而当CO2气腹压力为14mmHg时,3～4h组PCNA的表达明显高于1～2h组(P<0.05)。7. Ki-67的表达变化:CO2气腹各处理组Ki-67的表达均明显高于对照组(P<0.05)。当CO2气腹压力为0mmHg时,Ki-67的表达不受处理时间的影响(P>0.05)。当CO2气腹压力为7mmHg或14mmHg时,3～4h组Ki-67的表达明显高于1~2h组(P<0.05)。此外,无论处理时间长短,7mmHg组Ki-67的表达总是最高,14mmHg组Ki-67的表达总是高于0mmHg组而低于7mmHg组,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]在一定的处理压力和时间范围,CO2气腹上调凋亡抑制基因Survivin、Bcl-2和细胞核增殖抗原Ki-67、PCNA在CaSki细胞中的表达;CO2气腹下调凋亡效应蛋白酶Caspase-3的表达。表明CO2气腹可能通过促进CaSki细胞的体外增殖和提高CaSki细胞的抗凋亡能力而促进人宫颈癌CaSki细胞的体外生长。