研究背景糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病重要的微血管并发症。在引起终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的病因中,DKD也是最常见的疾病。进入21世纪以来,由于全球2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)的患者人数不断攀升,DKD对人类健康的危害也逐渐被认识。根据美国糖尿病学会(American diabetes association,ADA)的数据,T2DM 患者中进展为 DKD 的比例约在40%,在发达国家中,这个比例更高,达到50%左右。DKD的发病机制尚不完全清楚,但高血糖始终是引起和维持靶组织和器官持续性损伤的始动因素。长期的慢性高血糖可引起肾脏微血管循环的障碍,增加了肾小球囊内的压力,从而损伤了肾小球滤过屏障,同时加重了肾小球细胞外基质的堆积,对肾小管间质也会产生促纤维化的不利影响等。另外,高血糖状态下体内晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products,AGEs)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和各种炎性因子等产生增多,这一过程伴随着氧化应激和炎症的发生,加重了对肾脏的损害。长久以来,微量白蛋白尿被公认为是早期DKD的标记物,也是其主要诊断指标。按照ADA推荐,测定尿标本的尿白蛋白/肌酐比值(urine albumin to creatinine ratio,UACR)是筛查和确诊微量白蛋白尿的金指标。但也有不少研究发现,微量白蛋白尿在早期DKD的诊断上有一定的缺陷,不仅体现在微量白蛋白尿的发生与糖尿病患者的肾脏病变不一致上,同时还表现为微量白蛋白尿的进展与糖尿病患者肾功能的变化没有相关性。另外,白蛋白尿的测定还会受到一些特殊因素的影响,如运动、尿路感染和心力衰竭等。在临床上,正常白蛋白尿的糖尿病肾脏病(normoalbuminuria diabetic kidney disease,NADKD)患者也并不少见。这些都提示微量白蛋白尿可能并不是早期发现DKD的最佳标志物。鉴于此,临床迫切需要识别和发现比微量白蛋白尿更敏感、更特异的能够反映早期肾脏损伤的生物标志物,以尽早诊断DKD。目前DKD的标准治疗主要包括以下三个方面:强化血糖控制、严格血压达标和使用拮抗肾素血管紧张素系统的药物。近些年来,随着钠-葡萄糖协同转运蛋白-2(sodium-glucose cotransporter-2,SGLT-2)的作用逐渐被认识,人们对肾脏在高血糖的形成和维持中的作用产生了巨大的兴趣,肾脏作为糖尿病发病和治疗的靶器官地位也受到了更多的关注和研究,这导致了抑制SGLT-2的新药物的开发。SGLT-2抑制剂正是通过抑制肾脏对钠和葡萄糖的重吸收,增加尿葡萄糖排泄来防止血糖水平升高。除了降低血糖外,SGLT-2抑制剂还有其他作用,如减轻体重、降低血压、降低血清甘油三酯(triglyceride,TG)和尿酸(uric acid,UA)的水平。这些作用,不仅有助于T2DM患者更好的控制血糖,同时可能间接地预防和改善了糖尿病的慢性并发症,包括DKD。另外研究显示,抑制SGLT-2还可以产生直接的肾脏保护作用,包括减轻肾小球的超滤过和肾小管细胞的肥大,以及减少葡萄糖对肾小管的毒性作用。一些大型临床研究也表明,SGLT-2抑制剂延缓了 T2DM患者白蛋白尿发生、进展和肾功能下降的速度,降低了肾脏替代治疗或因肾脏疾病死亡的风险,对T2DM患者具有肾脏保护作用。关于SGLT-2抑制剂对于早期DKD的研究,目前还较少。因此,本研究分为两个部分,第一部分主要是探讨多种血清和尿液的生物标记物在早期DKD中的诊断价值。我们分别选择了与肾小球损伤、肾小管损伤、氧化应激和炎症等四个方面相关的13种生物标记物,期望可以寻找敏感性和特异性更高的早期DKD的诊断指标,为早期干预和治疗DKD、降低肾衰的发生风险提供临床数据。第二部分我们选择了一部分T2DM早期DKD患者,使用了第一个在中国上市的SGLT-2抑制剂——达格列净。观察了治疗前后,尿白蛋白和第一部分内容中对于早期DKD具有诊断价值的部分标记物的变化,探讨达格列净在T2DM早期DKD患者中的肾脏保护作用。第一部分血清和尿液生物标记物在2型糖尿病早期糖尿病肾脏病的诊断价值研究目的1.研究13种生物标记物在T2DM患者不同白蛋白尿期的变化,探讨其与UACR的相关性。2.应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)判断生物标记物在早期DKD中的诊断价值,试图创立有效的DKD诊断模型。方法1.研究对象与分组本部分纳入了入住安徽医科大学第二附属医院内分泌科治疗的287例(其中男性163例,女性124例)T2DM患者为研究对象,这些患者均符合1999年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的糖尿病诊断标准。分组主要根据UACR值,其中正常白蛋白尿组(normal albuminuria,NA组)144例(UACR≤30 mg/g)、微量白蛋白尿组(microalbuminuria,MA组)94例(30 mg/g<UACR≤300 mg/g)和大量白蛋白尿组(clinic albuminuria,CA组)49例(UACR>300mg/g)。对照组有42例,全部来自我院健康管理中心的正常体检人群。2.研究指标检测收集所有入组对象性别、年龄、身高、体重(weight,W)、血压,计算体重指数(body mass index,BMI)。T2DM患者需记录病程,收集眼底病变情况。所有入组对象空腹10小时以上,清晨采取静脉血,测定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbAlc)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、TG、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)、肌酐(creatinine,Cr)、胱抑素C(cystatin C,CysC)、UA、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数等,计算估计肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)和中性粒细胞/淋巴细胞比率(neutrophil to lymphocyte ratio,NLR)。采集所有入组对象空腹过夜后清晨第1次中段尿,测定尿白蛋白和Cr,用于计算UACR。同时测定尿转铁蛋白(transferrin,Tf)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、足细胞标记蛋白(podocalyxin,PCX)、中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-glucosaminidase,NAG)、α1 微球蛋白(alpha-1-microglobulin,α1MG)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-deoxyguanosine,8-OHdG)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)等。为了消除尿液浓度的影响,所有以上尿液指标均以尿Cr值作为校正。3.统计学分析利用SPSS 22.0统计软件开展统计描述和分析。应用Shapiro-Wilk法检查研究数据是否为正态性分布,使用均数±标准差代表具有正态性分布的变量,若不符合,应用中位数(四分位间距)来表示。组间的比较通过单向方差分析方法(ANOVA)进行统计,两组之间的比较使用Student检验进行分析;多组间非正态分布的材料比较使用秩和检验。定性的数据资料用构成比来记录,检验方法为χ2检验。采用相关分析检验生物标记物与UACR的相关性;多重线性回归方法用于分析各种生物标记物与UACR之间的关联;采用Logistic回归方法分析生物标记物与早期DKD的关系。采用ROC分析计算曲线下面积(area under the curve,AUC)、灵敏度和特异度等参数,来评价各种生物标记物和联合多种生物标记物的诊断价值。P<0.05有统计学意义。结果1.对照组、NA组、MA组以及CA组的年龄、BMI、病程、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的患病率、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、FBG、Cr、eGFR、TG、HbA1c 和 13 种生物标记物(尿 Tf、IgG、PCX、NGAL、NAG、α1MG、8-OHdG、TNF-α、IL-18和血CysC、TBIL、UA、NLR)的差异均有统计意义(P<0.05)。CA组的尿Tf、IgG、PCX、NAG、α1MG、8-OHdG、IL-18 和血 CysC、UA、NLR 较其它三组明显升高(P<0.05)。CA组的尿NGAL和TNF-α较对照组和NA组明显升高(P<0.05)。CA组的血TBIL较NA组和MA组降低(P<0.05)。MA组的尿Tf、IgG、PCX、NGAL、NAG、α1MG、8-OHdG、TNF-α、IL-18 和血 NLR 较对照组和NA 组明显升高(P<0.05)。NA 组的尿 Tf、PCX、NGAL、NAG、α1MG、IL-18和血TBIL较对照组明显升高(P<0.05)。2.多重线性回归分析结果显示,早期DKD患者的尿Tf、IgG、NGAL和TNF-α与UACR显著相关(P<0.001)。3.Logistic回归分析发现,尿Tf、IgG、NGAL和TNF-α与早期DKD的发生显著相关(P<0.05)。4.在调整相关协变量后,ROC曲线显示尿Tf、IgG、NGAL和TNF-α对T2DM患者早期 DKD 诊断的 AUC 分别为 0.876(95%CI:0.830-0.923)、0.910(95%CI:0.867-0.952)、0.896(95%CI:0.856-0.936)、和 0.813(95%CI:0.756-0.870)(P<0.001),四种标记物联合具有最高的AUC,为0.944(95%CI:0.913-0.975)(P<0.001)。结论1.早期DKD患者的尿Tf、IgG、NGAL和TNF-α与UACR显著相关,可以反映T2DM患者的早期肾脏损害。2.单个标记物的诊断价值方面,尿IgG>NGAL>Tf>TNF-α;尿Tf、IgG、NGAL和TNF-α的联合应用对于T2DM早期DKD患者具有良好的诊断价值。第二部分达格列净对2型糖尿病早期糖尿病肾脏病的肾脏保护作用探讨目的观察达格列净对T2DM早期DKD患者UACR和其它生物标记物的影响,探讨达格列净对T2DM早期DKD患者的肾脏保护作用及机制。方法1.研究对象与分组研究对象来自2018年1月至2019年3月期间在安徽医科大学第二附属医院内分泌科住院的T2DM伴早期DKD患者185例,调整降糖方案,达格列净组使用达格列净10mg一天一次,对照组可接受SGLT-2抑制剂以外的降糖药物治疗。血糖控制稳定后出院,每4周内分泌科门诊随访一次,记录低血糖事件和其它不良反应,共随访24周。2.指标检测记录入院时患者性别、年龄、糖尿病病程、合并症、用药情况、血压、身高、W,计算BMI。隔夜10小时以上抽取静脉血,测定FBG、HbA1c、TC、TG、LDL、Cr、CysC和UA,计算eGFR。收集晨起时中段尿,测定尿白蛋白、Cr、Tf、IgG、NGAL和TNF-α,计算UACR。24周后,再次测量患者血压、W,计算BMI,并重新检测上述指标。为了消除尿液浓度的影响,所有以上尿液指标均以尿Cr值作为校正。3.统计学方法应用SPSS22.0软件进行统计分析。应用Shapiro-Wilk检验方法判断所有计量数据样本分布的正态性,使用均值±标准差来描述正态分布资料,若非正态,则以中位数(四分位间距)来表示。对于正态数据之间的组间比较,利用独立样本的t检验方法,配对t检验法用于组内比较。使用Mann-Whitney U检验检测非正态数据的组间比较,组内之间的对比采用Wilcoxon检验。用频数(%)来代表计数变量,对于这一部分数据组与组之间的比较采用Pearson卡方检验方法和Fisher精确检验分析。Logistic回归分析评估UACR改善与基线变量和治疗前指标之间的关联。P<0.05为有统计学意义。结果1.达格列净组和对照组完成随访的各89例,两组的性别、年龄、病程、合并症、使用药物等无统计学差异(P>0.05)。两组治疗前的SBP、DBP、W、BMI、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL、UACR、eGFR 和血 Cr、CysC、UA 以及尿 Tf、IgG、NGAL、TNF-α差异无统计意义(P>0.05)。2.与治疗前比较,达格列净组治疗后的SBP、DBP、W、BMI、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL、UACR 和血 UA 以及尿 Tf、NGAL、TNF-α均明显降低(P<0.05);对照组治疗后的 SBP、DBP、W、BMI、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL 和血 UA均明显降低(P<0.05)。3.治疗24周后,与对照组比较,达格列净组的W、BMI、TG、UACR和尿Tf、NGAL、TNF-α均明显降低(P<0.05)。4.Logistic回归分析显示,UACR的改善与达格列净的治疗和无高脂血症呈显著相关(P<0.05)。5.达格列净组的低血糖、生殖道和泌尿道炎症、消化道症状以及糖尿病酮症酸中毒(diabetes ketoacidosis,DKA)的发生率与对照组比较,差异均无统计意义(P>0.05)。结论达格列净治疗可明显降低T2DM伴早期DKD患者UACR和尿Tf、NGAL、TNF-α排泄,提示达格列净对T2DM患者的肾脏具有保护作用。该作用可能与达格列净降低肾小球的高滤过、改善肾小管功能和减轻体内炎症有关。