目前常用的重组蛋白表达系统有大肠杆菌系统、活性杆状病毒系统、酵母表达系统以及哺乳动物细胞表达系统等。近来快速发展起来的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统由于其具备高效表达、高遗传稳定性、分子遗传学操作简单而且作为一个真核表达载体，能够对目的蛋白进行翻译后加工和修饰等优点而被广泛应用。根据需要可进行胞内或者是胞外分泌型表达，胞外分泌型表达纯化工艺简易、生产成本低可进行工业化生产。在具有众多优点的同时，毕赤酵母也有一些缺点，包括分泌型蛋白容易被蛋白酶水解；糖基化形式与人类存在着差异等。 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母表达系统内是否能够实现高效表达还受到很多因素的影响。其中包括外源基因的密码子组成；外源基因的拷贝数；宿主菌表型；表达载体和启动子；分泌信号肽；m RNA的二级结构；发酵条件等。 骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是一类蛋白质生长因子，BMPs能够强烈诱导骨和软骨的形成而且在早期骨骼发育中有着重要作用。其中骨形态发生蛋白4又称骨形态发生蛋白2B，BMP4不仅在胚胎发育早期对眼睛的发育起着关键的作用而且在出生后甚至到成人都对视网膜的发育有着重要作用。已有实验表明BMP4在体内具有诱导异位成骨能力，BMP4是造血细胞和神经细胞的分化因子，也能够诱导C2C12细胞系朝成骨分化。 hBMP-4基因位于人类的第14号染色体上，cDNA全长是1224bp，它编码408个氨基酸构成的前.前体蛋白，包括信号肽(第1-19位氨基酸)，前导肽(第20-292位氨基酸)，成熟肽(第293-408位氨基酸)三部分。hBMP-4在人细胞内是以前。前体蛋白(pre-proprotein)的形式合成的，在成熟肽的N端有被FURIN识别的-RAKR一位点，FURIN把前导肽从成熟肽的N端切离，从而把前体蛋白加工为116个氨基酸的成熟蛋白。hBMP-4成熟蛋白带有2个N糖基化位点(第350和365位氨基酸)，并含有TGF-β家族共有的7个半胱氨酸的保守区，其中6个半胱氨酸残基形成3对分子内二硫键，第7个(第372位氨基酸)半胱氨酸残基通过分子间二硫键介导hBMP-4同型或异型二聚体的形成。 分子伴侣是一类能够帮助其它大分子正确折叠、去折叠、组装、去组装但并不是这些大分子最终结构的组成成分的蛋白总称，它的底物包括蛋白质和RNA。某些蛋白的前导肽也具有类似分子伴侣的功能即能够辅助成熟肽的正确折叠，为了与分子伴侣区别开来将其称为分子内分子伴侣。它与分子伴侣的最大不同是它与所辅助的蛋白是处于同一个结构基因内，与成熟肽的N端共价连接。 hBMP-4作为一种生长因子，它在临床应用和科学研究上有着重要的意义，可用于由于手术、肿瘤、置换或创伤造成的骨损伤、骨折的修复，在某些情况下也可以修复软骨、肌腱和韧带。目前主要用成本高、技术难度高的CHO细胞来表达hBMP-4，难以满足市场需求。 因此本研究尝试利用已被广泛应用的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)真核表达系统表达hBMP-4，探讨在此表达系统中能否获得具有生物活性的thBMP-4，研究能否获得二聚体结构的thBMP-4，主要工作内容简述如下： 1 在已经获得整合有编码hBMP-4成熟肽cDNA(全序列优化)重组菌株(命名为G8)的基础上进行高密度发酵，建立了高密度发酵工艺：转速500rpm、温度28℃、pH 6.0、起始诱导OD 20、甲醇诱导浓度1％、甲醇诱导时间96h、通气量为发酵体积的1.5倍。用Dotblot方法结合Gene tools量化分析软件，对高密度发酵和小量摇瓶发酵的目的蛋白表达量进行量化分析，结果表明高密度发酵的表达量约是小量摇瓶发酵的5倍。 2 建立重组菌株发酵产物纯化工艺：首先将收集到的发酵上清液用分子量为5KD的中空纤维超滤器超滤浓缩，将收集到的浓缩液用分子筛凝胶层析柱G-25脱盐和去除色素，接着把收集到的样品经SP阳离子凝胶层析后再经肝素亲和凝胶层析两步纯化，纯化后的样品经SDS-PAGE电泳(考马斯亮蓝染色)结合Gene tools量化分析软件分析其纯度达到90.3％。 3 G8酵母转化子表达产物N-糖基化分析：将纯化后的样品经过N-糖基化酶(Endo Hf)处理后WESTERN-BLOT分析，实验结果表明未经过N-糖基化酶(Endo Hf)处理G8酵母转化子表达产物的分子量不均一，其中大部分集中在60KD到100KD之间，而切除糖链后表达产物集中在约14KD的位置上与hBMP-4成熟肽单体分子量13KD比较接近，说明thBMP-4在毕赤酵母中以单聚体的形式存在且出现不同形式的高度糖基化。 4 G8酵母转化子表达产物N端加工不完全：经过Endo Hf去糖基化处理的G8酵母转化子表达产物在约14KD处有两条能被特异性第一抗体Mouse Anti-hBMP-4所识别的条带，说明G8酵母转化子表达产物thBMP-4的前体蛋白在翻译后加工过程中N端加工不完全。 5 小鼠肌袋包埋法和碱性磷酸酶活性测定法鉴定纯化后的thBMP-4生物活性。 ① 小鼠肌袋包埋法：秤取12mg纯化后的thBMP-4冻干粉重新溶在20ul浓度为5mM的PB缓冲液中，将4条长约0.5cm牛胶原蛋白浸泡其中约30min。挑选四只雄鼠将已经处理好的牛胶原蛋白移植到大腿前侧股四头肌肌纤维中，同时设置阳性和阴性对照组。实验动物术后10天采用颈椎脱位法处死后取下植入部位进行组织切片，切片厚度7um，常规HE染色后显微镜观察发现实验组和阳性对照组中，植入区有大量的软骨细胞生成，而阴性对照组内只有肌肉细胞和间充质细胞，说明纯化后的thBMP-4具有异位诱骨能力。 ② 碱性磷酸酶活性测定法：将保存在-80℃粉末状的thBMP-4重新溶解在5mMPB缓冲液中，以市售的thBMP-4(NSO)为标准蛋白，用ELISA方法测重溶后的thBMP-4浓度，待测thBMP-4吸光值平均值为0，807667，根据ELISA数据分析结果计算得知thBMP-4的浓度为78.3ng/ul。以人表皮成纤维细胞为实验对象，设置四组实验组：第一组加入1ul的thBMP-4溶液；第二组加入10ul的thBMP-4溶液；第三组加入30 ul的thBMP-4溶液；第四组加入50 ul的thBMP-4溶液并且每组实验设置3个平行实验，同时以设置阴性对照组，诱导四天后鉴定人表皮成纤维细胞内碱性磷酸酶活性，实验结果表明出人表皮成纤维细胞在经过纯化后的thBMP-4诱导细胞内碱性磷酸酶活性明显上升，说明人表皮成纤维细胞正朝着软骨细胞方向分化，而且在一定诱导浓度范围内诱导浓度和人表皮成纤维细胞内碱性磷酸酶的活性呈正相关关系。 6 二聚体结构形式thBMP-4的获得：pPIC9K表达载体经BamH I、EcoR I两种限制性内切酶酶切以去除pPIC9K表达载体上的α-信号肽，再将编码hBMP-4的全长cDNA克隆在该表达载体上后电转化毕赤酵母GS115。PCR筛选阳性重组子后进行摇瓶表达目的蛋白的实验，发酵产物经还原和非还原处理后再经SDS-PAGE和WESTERN-BLOT分析结果表明部分thBMP-4以二聚体的形式分泌到胞外。