基于高通量测序的济宁青山羊和莱芜黑山羊卵巢转录组研究

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目的:采用Solexa高通量测序技术对济宁青山羊和莱芜黑山羊发情后卵巢组织转录组进行测序和功能分析,重点分析新发现的未注释的新基因以及与繁殖性能相关的基因,分别检测了处于自然发情期的济宁青山羊和莱芜黑山羊卵巢组织的基因表达情况,以期找出调控山羊高繁多胎基因,探讨多胎的遗传机制,以及济宁青山羊和莱芜黑山羊品种间繁殖力差异的分子生物学机理。方法:1.本实验选取青岛奥特种羊场各项指标符合实验要求的莱芜黑山羊和济宁青山羊各5只,对这10只母羊进行同期发情处理。鉴定发情的方法我们采用的是阴道检查法和公羊试情法,母羊发情发后四到五小时内将其屠宰,把卵巢组织取出后,剪碎放入冻存管,编号并且迅速放入液氮罐中,用于提取组织总RNA。2.对莱芜黑山羊和济宁青山羊卵巢组织中提取的总RNA进行纯化,然后构建solexa测序文库,将构建好的文库进行Solexa测序,进行差异表达基因筛选。通过差异表达基因GO分析与Pathway分析,筛选出莱芜黑山羊和济宁青山羊之间差异表达的基因,对新基因做功能注释和富集分析,可以分别得到差异表达基因的蛋白质和COG功能注释。根据蛋白数据库注释信息我们能得到GO功能注释。根据KEGG数据库,通过显著性富集分析,确定差异表达基因参与的最主要生物化学代谢途径和信号通路。结果:1. Solexa高通量测序得到样品莱芜黑山羊和济宁青山羊的Reads,样品莱芜黑山羊和济宁青山羊的数据量各约4G,所有数据GC含量的百分比也在50%以下,Cycle Q20值比较接近100%,说明测序的准确度比较高,数据质量很好,满足进一步分析的要求。2. Insert size是信息分析时一个很重要的参数,Insert size检验反映了切胶时所切片段的实际范围。通过对样品插入片段分布的检测,可以看到每个样品的插入片段主要分布在100-150bp的范围之内,和实验的切胶范围吻合;其中样品莱芜黑山羊,插入片段峰值在130左右,而且分布集中,说明样品切胶效果,测序效果很好,同样,济宁青山羊的插入片段也是集中的分布在130左右,进一步说明测序数据质量很好,满足信息分析需求。3.比对信息统计是对Reads在参考基因组上的整体情况进行统计,它在一定程度上能反映测序水平的高低或者所选参考基因组的优劣,以及后期分析水平的可靠程度。结果显示两个样本的完美匹配的片段数目都超过了匹配片段的一半以上。结论:1.通过Solexa测序,我们共获得高质量约4G的测序数据,其中包括莱芜黑山羊9732297个Reads,济宁青山羊9613952个Reads;发现未预测到的基因其中莱芜黑山羊有3060个,济宁青山羊有3348个。2.通过差异表达基因GO分析与Pathway分析,筛选出莱芜黑山羊和济宁青山羊之间的差异表达基因和代谢调控通路,与山羊繁殖有关的通路有:CAM配体、粘着斑、细胞抗原、ECM-受体互动、细胞粘附分子、嘌呤代谢等。
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