埃博霉素(Epothilones)是纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一类新型大环内酯类天然化合物,具有高效抗肿瘤活性,是理想的抗肿瘤药物。但是其原始产生菌株纤维堆囊菌生长周期长,因此,利用基因工程技术进行异源表达、定向改造埃博霉素基因簇以及优化宿主菌株发酵条件,成为缩短生长周期、提高生产效率的有效途径之一。通过培养基优化提高发酵产物的效价,是发酵条件研究中一个很重要的步骤。本实验室已实现埃博霉素在伯克氏菌中的异源表达,但是产量不理想,本研究拟在此基础上对工程菌株发酵条件进行摸索,为促进埃博霉素在工程菌中的高效表达、提高埃博霉素产量提供基础。本研究比较分析了6种培养基对伯克氏菌菌体浓度的影响及菌体生长密度与细胞毒素产量及活性的关系。结果显示3号培养基稳定期细菌生长密度最大,OD600最大值可达到12.58,是同时期2号培养基的3倍,1、4、5、6号的6倍。1、4、5、6号细菌最大OD600值都不超过2,5号的菌体细胞生长量最低,最大值仅1.2。1-6号培养基培养的埃博霉素工程菌株的发酵粗提物对细胞的抑制率分别为57.94%、83.81%、65.36%、1.87%、7.74%、57.76%。结合该6种培养基的生长曲线,显示当菌体浓度OD600值不超过6时与埃博霉素产量之间为正相关关系,菌体密度过高时,增加菌体量并不能增加埃博霉素产量。前体物质在目的产物合成过程中起到至关重要的作用,添加适当的前体物质可以有效地提高发酵产物效价。为了研究不同前体物质对埃博霉素产量的影响,本实验选取了6种不同前体物质对埃博霉素工程菌进行发酵条件优化。结果表明前体物质对埃博霉素产量影响效果B(丙酸钠)>D(丝氨酸)>F(微量元素)>C(柠檬酸钠)>A(乙酸钠)>E(半胱氨酸)。分别添加不同浓度(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)的丙酸钠,粗提物对B16细胞的抑制率从57.94%分别提高到89.18%、92.8%、91.21%,添加5μg/mL的丝氨酸,粗提物对B16细胞的抑制率从57.94%提高到92.55%。但过量的半胱氨酸和乙酸钠对工程菌埃博霉素产量有一定的抑制作用：添加80μg/mL的乙酸钠,粗提物对B16细胞的抑制率从57.94%下降到56.05%,；添加10μg/mL的半胱氨酸,粗提物对B16细胞的抑制率从57.94%下降到14.57%。利用强启动子启动后续基因的转录,可极大地促进目的基因的表达。为了进一步提高埃博霉素的产量,本研究通过一系列酶切连接和Red/ET同源重组基因工程技术,分别构建了质粒pR6K-Amp-H.a-f-Ptet-H.a-r和质粒pR6K-H.a-f-PBAD-H.a-r,该质粒以R6K为复制子,包含有启动子PTet或PBAD及埃博霉素原有启动子的上下游同源臂。以期转入埃博霉素工程菌中,替换其原有启动子,促进埃博霉素的生物合成。强启动子质粒的构建为促进埃博霉素在工程菌中的高效表达奠定了基础。