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磁性氧化铁纳米粒子（简称为FeNPs）因良好的生物相容性在生物医学领域具有巨大的应用潜力。当前，一些氧化铁纳米粒子已经被应用为磁性靶向药物载体、补铁剂、磁共振成像(MRI)对比增强剂、细胞标记物等。因此，其相关毒理性效应研究具有重要意义。FeNPs潜在纳米毒性已被逐渐意识，并进行了系列研究，主要体现在细胞水平，如纳米的内化能力和方式，对细胞超微结构、生长活力、氧化应激等方面的影响。随着基因芯片技术的发展与日渐成熟，能检测基因组范围内所有基因表达。纳米处理细胞后，细胞可迅速地改变它们的转录输出，即基因表达谱，以适应这种变化。在细胞或组织水平筛选鉴别表达受纳米材料影响的所有基因可以为识别任何潜在的纳米毒性及其相关分子机制提供有价值的线索。因此，采用高通量技术评价基因表达谱的变化有助于确定纳米材料潜在的纳米毒性。当前研究表明，我们需要系统地研究纳米颗粒粒径、电荷、形态及表面修饰等多因素的影响，探究其潜在分子机制，并加以开发应用。 静脉注射给药后，纳米材料由于被动靶向性在体内的血液和肝细胞中富集最多最密集。本研究以两种小鼠和相应两种人的血液细胞和肝癌细胞，即小鼠巨噬细胞RAW264.7、小鼠肝癌细胞Hepa1-6、人急性单核细胞THP-1和人肝癌细胞HepG2为研究对象。分别用不同剂量二巯基丁二酸(DMSA)修饰的Fe3O4纳米颗粒(简写为DMSA-FeNPs)处理四种细胞，运用基因芯片技术检测DMSA-FeNPs细胞基因表达谱。通过深入分析数据结合实验验证，从基因水平上探究DMSA-FeNPs与各细胞互作对基因表达的影响、潜在分子机制及可能应用。主要工作如下: 1.本章运用透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)、红外光谱检测、普鲁士蓝染色及CCK-8细胞活力检测试剂盒，表征了DMSA-FeNPs磁性纳米粒子特性，探究了其细胞内化及对细胞活力的影响。TEM和DLS结果表明，DMSA-FeNPs平均粒径约11nm，水动力尺寸约64 nm，在溶液中具有良好的分散性，且稳定性良好;普鲁士蓝染色检测显示四种细胞均能摄取DMSA-FeNPs，RAW264.7吞噬量最高，而THP-1相对最低。TEM观察可见DMSA-FeNPs以囊泡包覆形式定位于细胞质中。对细胞活力的测定表明，100μg/mL的DMSA-FeNPs引起部分细胞活力下降，50μg/mLDMSA-FeNPs未对细胞活力产生明显抑制，反而显著提高了小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖。巨噬细胞是抵御病原体入侵和激活适应性免疫的一类重要免疫细胞，在肿瘤的发生和发展中起到非常重要的作用。这一发现为研究氧化铁磁性纳米粒子激活巨噬细胞进行免疫治疗提供了依据。 2.评价纳米材料毒性一个可行的策略是先评价小鼠细胞的毒理学效应，再等效评价人细胞效应。本实验室前期已经评估了DMSA-FeNPs对两种小鼠细胞系的毒性效应，本章则在于评价该纳米材料对两种等效的人细胞系（THP-1和HepG2）的毒性影响。取同一批次DMSA-FeNPs对应相同剂量（0、50μg/mL和100μg/mL）对细胞处理相同24 h，检测细胞全基因表达谱。分析发现，两种细胞系内分别有几百个DMSA-FeNPs应答基因(FeRGs)，且两种细胞中FeRGs大多数是不同的，表明细胞类型特异性效应。通过比较这些FeRGs、注释功能和相关KEGG通路，发现DMSA-FeNPs引起的相同和细胞特异性生物效应。THP-1细胞中，DMSA-FeNPs产生的综合效应是诱导各种反应和抑制蛋白翻译，而HepG2细胞内则表现为促进细胞代谢、生长和迁移。这些效应均体现出纳米剂量依赖性，即高剂量DMSA-FeNPs相对低剂量对细胞的影响更大。通过进一步比较两种人类和两种小鼠相应细胞系中DMSA-FeNPs诱导的共同基因、生物学过程及KEGG通路，发现四种细胞系中Id3基因共同下调。Id3基因是一个氧化还原敏感性信号传导分子，其编码的蛋白还可形成非功能性二聚体与其他转录因子抑制转录，其显著下调表明DMSA-FeNPs可能扰乱了细胞正常的生物学过程，如细胞生长、分化、凋亡及肿瘤发生等。因此，Id3基因可作为DMSA-FeNPs细胞毒性的一个通用和敏感的生物标志物，为探索和鉴定DMSA-FeNPs纳米毒性提供了新的见解。 3.前面研究中的差异表达基因(DEGs)功能注释(GO)分析发现THP-1细胞中两种剂量下均富集有对病毒的应答反应过程，且C型肝炎病毒通路也被显著富集，而本研究中DMSA-FeNPs和病毒具有相似的粒子结构，暗示THP-1细胞将DMSA-FeNPs类似病毒识别，从而产生类似病毒样的细胞免疫效应。本章通过数据深挖，探讨了DMSA-FeNPs对两种免疫细胞（RAW264.7和THP-1细胞）免疫系统的影响，而免疫系统正是细胞用以抗病毒的最重要宿主防御系统。结果表明，DMSA-FeNPs引发了两种细胞类似于病毒的综合免疫反应，主要包括8类先天免疫和3类适应性免疫，并产生大量不同类型的细胞因子。分析还发现几乎一半的DEGs是干扰素刺激基因(ISGs)，它们与抗病毒密切相关，如Osa1/2/3/L、Mx1/2编码最典型的抗病毒因子。免疫应答和细胞因子产物均显示剂量依赖性和细胞类型依赖性效应。似病毒免疫效应可能是由于DMSA-FeNPs粒径大小与病毒相近，DMSA表面修饰类似于病毒的蛋白质外壳（称为衣壳）或脂质包膜，DMSA-FeNPs同病毒一样带负电荷，呈类似于许多病毒的单分散球形颗粒形状等因素。实验研究进一步发现，DMSA-FeNPs在体外能激活RAW264.7细胞，显著提升该细胞生长活力、迁移力和攻击力，能在体外有效杀死小鼠肝癌细胞Hepa1-6。因此，本研究在基因转录水平上报道了DMSA-FeNPs对细胞的免疫应答系统效应，挖掘DMSA-FeNPs自身在肿瘤免疫治疗中的潜在应用，为其细胞生物效应和潜在的分子机制提供了新见解，促进了具有良好免疫特性的新纳米材料的设计开发，并推动了DMSA-FeNPs自身作为免疫治疗药物的研究与应用。 4.DMSA已经被广泛用于对FeNPs的修饰，可以显著改善FeNPs的稳定性，生物相容性，细胞内化和生物学分布。尽管如此，我们注意到DMSA修饰氧化铁纳米颗粒后，携带大量还原性巯基进入细胞内，其潜在的细胞毒性还有待充分阐明。本章以八个含有大量二硫键的关键词在NCBI数据库中进行搜索，尽可能找到所有富含半胱氨酸蛋白(CRP)编码基因。通过比对筛选出由三个剂量（30、50和100μg/mL）DMSA-FeNPs处理三个时间点（4、24和48 h）的RAW264.7细胞中的编码富含半胱氨酸蛋白的差异表达基因(CRP-DEGs)。结果显示，每种处理下均有约四分之一的基因编码CRP，表明CRP基因（如锌指蛋白基因）的表达受到显著影响。进一步分析发现，所有CRP-DEGs中约31％的基因编码酶，表明该DMSA-FeNPs极大地影响了酶基因的表达。GO分析表明，DMSA-FeNPs诱导各种应答、免疫活性和细胞凋亡等生物学过程，分子功能则主要与铁离子结合有关。同时，在Hepa1-6、THP-1和HepG2这三种细胞系中也发现类似效应。为了确证CRP基因差异表达源自修饰分子DMSA，本研究采用定量聚合酶链式反应(qPCR)同步检测了DMSA-FeNPs、聚醚酰亚胺(PEI)修饰的Fe3O4磁性纳米粒子(PEI-FeNPs)及纯DMSA分子对部分典型CRP-DEGs表达的影响。结果发现该DMSA-FeNPs对CRP基因表达的影响主要是由DMSA-FeNPs带入细胞内的DMSA造成的。本研究报道DMSA作为FeNPs纳米表面修饰分子在基因转录水平上的细胞毒性效应，为DMSA-FeNPs显著影响CRP基因差异表达提供了新的分子机制，为纳米材料表面修饰分子的生物相容性评价提供了新思路。