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斑秃是一种相当普遍的损容性、以遗传为基础的自身免疫疾病,它是一种受多种基因控制的、主要侵犯生长期毛囊的疾病,常常与其它系统性自身免疫疾病相关联。然而,由于缺乏适当的动物模型,对这种疾病机制及治疗对策的研究受到阻碍。我们的目的是建立一种良好的类似于人类斑秃发病的动物模型以更深入研究这种疾病。利用全层皮肤移植技术诱导C3H/HeJ小鼠发生类似斑秃的脱发,建立C3H/HeJ小鼠斑秃模型;利用Affymetrix基因芯片技术结合QPCR技术和Ingenuity Pathways Analysis软件分析,鉴定斑秃病理过程当中的分子信号通路,并筛选经美国FDA批准的药物,特别是未曾应用到斑秃治疗当中去的新药,这些药物将在我们的斑秃小鼠模型中进行检验,为人类斑秃疾病治疗提供可靠信息。斑秃具有复杂多基因性状,与人类遗传特征相类似,在以往利用简单片段长度多态性基因组标记(SSLPs)及数量性状位点(QTL)定位的基础上,利用单倍型原理及最新最全的单核苷酸多态性标记(SNPs)数据库寻找到斑秃候选基因Tap2。在完成这些工作的基础上,我们的远期目标将采用比较基因组的方法,在人类全基因组范围内进行类似的研究,这些先进的分子生物信息学研究手段将在斑秃的药物开发和诊断筛查方面发挥重要作用。一、C3H/HeJ小鼠全层皮肤移植诱导斑秃的动物模型的建立C3H/HeJ小鼠中自然发生的毛发脱失疾病与人类成年发作的斑秃十分相似,我们目的就是建立一种适合研究斑秃的小鼠模型。我们采用全层皮肤移植的方法,诱导正常健康小鼠产生类似于斑秃的疾病,并且动态观察移植术后小鼠的发病情况,分别在移植术后第5,10,15和第20周对各实验组及对照组小鼠标本进行常规组织病理切片,免疫荧光CD8+和CD4+抗体标记。结果表明:①几乎所有接受斑秃病变皮肤移植的小鼠从第五周开始出现脱发,呈现进行性发展,到第20周小鼠毛发几乎完全脱落。②组织病理切片显示发生脱发的移植组小鼠几乎所有的毛囊处于毛发生长期或静止期初期阶段。毛囊周围,介于毛囊隆凸部位与皮脂腺之间的生长期毛囊周围出现各种淋巴细胞浸润并可见毛囊萎缩,毛发纤维变性,断裂。③免疫荧光标记表明斑秃小鼠毛囊内部及周围浸润的细胞主要为CD4+/CD8+ T淋巴细胞,主要为CD8+ T细胞。结论:斑秃是种细胞介导的自身免疫疾病,CD8+ T细胞在小鼠斑秃的免疫应答中主要作用。利用全层皮肤移植诱导斑秃的发生,这是一种可控制的、并且可预测的方法,容易获得大量斑秃小鼠的模型,用来验证斑秃机制的各种假说,特别是深入探讨斑秃发病的分子学机制、观察各种药物疗效等,为斑秃的基础研究提供强有力的实验工具,C3H/HeJ小鼠斑秃模型是目前用于研究斑秃的最佳动物模型之一。二、鉴定斑秃的基因分子网络信号通路及治疗的药物靶向斑秃的研究已有近百年的历史,但其发病机制仍不清楚,人类斑秃研究大多是关于基因的相关性方面的研究,集中研究特定基因或群体基因之间的连锁关系。直到C3H/HeJ小鼠斑秃模型等适合斑秃研究的动物模型得到应用后,大大加速了斑秃分子机制研究的步伐。我们研究目的是深入探讨斑秃的基因分子网络信号通路,寻找新的斑秃治疗的药物靶向。我们采用Affymetrix? Microarray基因表达工具(GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array)和QPCR技术手段,结合Ingenuity Pathways Analysis?软件分析系统,将接受斑秃病变皮肤移植术后第5、10、15和20周以及自然发生斑秃的小鼠皮肤转录物与各自相应的正常对照组小鼠皮肤基因表达结果相比较后,发现斑秃疾病过程中大量表达异常的基因,并鉴定出许多可能参与斑秃发病过程的、与皮肤免疫反应有关的分子网络信号通路。结果:①CD8a,b在疾病发展各阶段表达呈现稳定上升趋势,CD4表达轻度上升,QPCR结果进一步定量证明了CD8a,b和CD4表达异常性,因此再次强有力地证明了CD8+、CD4+ T淋巴细胞参与了斑秃发病的免疫反应。②趋化因子在小鼠斑秃发病过程中呈现显著高表达。CXCL9、10、11,CCL5在小鼠移植术后各时期表达均呈显著增高,说明趋化因子在斑秃免疫调节机制中起到一定作用。③此外STAT1、MMP13、GAMA和GZMB也呈现显著异常高表达。④发现许多基因的蛋白产物是已知的经FDA认证的药物靶向,并发现针对这些基因的调节药物大多用于治疗其他疾病而未曾用于治疗斑秃,根据疾病发展的不同时期基因表达异常程度不同,寻找到相应的药物靶向。以上结果进一步说明说明斑秃是一种细胞免疫介导的自身免疫疾病,我们首次提出趋化因子可能在其发病机制中扮演重要角色。我们还首次提出针对斑秃发展过程中不同时期表达异常的基因采用不同药物进行干预的个性化治疗是未来治疗斑秃的对策,通过我们的研究进一步从分子水平探讨斑秃的发病机制,并有望开发斑秃治疗的新型药物。三、利用单倍型原理寻找并确定Tap2为小鼠斑秃的主效候选基因在本试验室利用传统的QTL基因定位方法对斑秃进行基因定位研究基础上,寻找小鼠斑秃候选基因。利用单倍型原理,使用最新Mouse Phenome Database数据库中SNPs信息,比较A/J和C3H/HeJ(发生斑秃品系)和C57BL/6J及DBA/2J(不发生斑秃品系)品系间的SNPs差异,找出候选基因,进而在Affymetrix Microarray Data中进一步分析其在小鼠斑秃中表达情况,最后利用Ingenuity Pathways Analysis?软件分析候选基因在C3H/HeJ小鼠斑秃免疫应答过程中可能的信号传导通路。结果发现,位于17号染色体上Alaa1区间18.62 cM的Tap2为小鼠斑秃主效候选基因。在小鼠移植术后第10周开始表达开始增高,到第20周是表达达到高峰。分子信号通路表明内、外源性抗原降解成肽段后,通过内质网膜上的Tap2将转运到内质网腔中,使之与新合成的MHC I类分子结合成抗原肽-I类分子复合体,经高尔基体转运到细胞表面,供CD8+ T细胞识别。因此我们得出的初步结论是,Tap2为小鼠斑秃候选基因,它是参与免疫应答的重要因素之一,在斑秃发病机制中可能扮演重要角色。本研究利用世界先进的单倍型生物信息学手段,首次提出Tap2为斑秃的主效候选基因,是斑秃研究中的新发现。