γ-聚谷氨酸是一种由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基缩合而成的天然高分子聚合物,它作为一种绿色新型环保型材料,拥有优良的吸水性、粘结性及可降解性,在多个领域都有优越的表现,越发受到人们的关注,人们对制备γ-聚谷氨酸的研究也越发活跃。目前采用的主要生产方法是微生物发酵法,因为它的生产条件温和易控制,合成流程短易大规模化生产,但是存在不同种微生物合成,菌株产量较低,代谢途径复杂,合成机理尚不清楚等问题,制约了 Y-聚谷氨酸的研究。因此一方面要积极寻找、筛选高效生产Y-聚谷氨酸的野生菌株并优化其培养基和发酵条件,另一方面深入研究γ-聚谷氨酸的合成机制和途径,从分子生物学的层面上真正了解γ-聚谷氨酸。本文主要从Y-聚谷氨酸高产菌株的选育、发酵条件优化及其抗逆性着手,为工业化生产和应用提供指导。1.从多种高氨基酸发酵食品中筛选,利用产γ-聚谷氨酸的菌落表面光滑、黏度大的特性初筛了 200株菌株,用CTAB法测定Y-聚谷氨酸的产量进行复筛,在豆豉中得到了一株初始产量为7.67g/L的γ-聚谷氨酸的高产菌株,命名为ZJS18。对它进行革兰氏染色,判断为阳性菌,进行芽孢染色,断定为芽孢杆菌。接下来对它进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定,通过16SrDNA序列扩增、BLAST 比对、构建系统发育树,初步断定菌株ZJS18为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。2.对筛选得到的菌株ZJS18进行各种培养基成分和培养条件的优化,提高了γ-聚谷氨酸的产量。首先对碳源、氮源、谷氨酸前体物、金属离子、培养温度、摇瓶转速、发酵液pH等进行了单因素试验,考察了它们对γ-聚谷氨酸产量的影响,然后采用Plackett-Burman试验设计筛选出了对Y-聚谷氨酸合成影响较大的3个因素,即蔗糖、酵母粉和谷氨酸钠。通过最陡爬坡实验确定了响应面中心点,再进行Box-Behnken试验设计和响应面法对这3个因素进行优化,对数据进行二次多项回归拟合,获得的二次多项回归方程确定最佳发酵条件为:蔗糖64.40 g/L、酵母粉7.10 g/L、谷氨酸钠57.96 g/L,氯化钠30 g/L,硫酸镁0.3 g/L,磷酸氢二钾2g几,初始pH 7.5,接种量5%,装液量40 mL/250 mL,温度37℃,摇床转速200 r/min,发酵时间36 h。在上述条件下,枯草芽孢杆菌ZJS18发酵生产γ-聚谷氨酸的产量为13.20 g/L。优化后的芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸的最佳发酵条件与未优化前相比,产量提高了 1.88倍。研究结果为γ-聚谷氨酸的生产和应用奠定了良好基础。3.γ-聚谷氨酸是一种胞外聚合物,具有抵御外界不良环境的能力,对优化好的菌株ZJS18进行热冲击、pH冲击及渗透压冲击3种环境冲击,探究它的抗逆性,发现它对热冲击和渗透压冲击有良好反应。接下来通过热冲击和渗透压冲击对内源谷氨酸的合成途径进行探究,选择5种合成途径中不同阶段的催化酶:谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、L-谷氨酸合酶和六磷酸葡萄糖脱氢酶,通过测它们在不同冲击下的酶活,探究它们对Y-聚谷氨酸的合成的影响,以此推断γ-聚谷氨酸的合成途径,建立一种新的提高Y-聚谷氨酸产量的方法。