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背景:恶性肿瘤在全世界已经成为危害人类健康的主要疾病。肝癌是常见的原发性恶性肿瘤之一,其致死率在全球恶性肿瘤致死率中排在第三位。目前多数患者通过化疗、放疗及手术方法治疗肿瘤,但治疗效果不佳。近年来,融合细胞疫苗在肿瘤免疫治疗中有很好的应用前景,如何提高融合细胞疫苗的活性是当前急需解决的问题。适配体能结合特定靶标,在肿瘤的靶向诊断和治疗方面有极大的潜力。TLS11a是针对小鼠肝癌细胞BNL.1ME.A.7R.1的核酸适配体,本课题组前期研究发现其能与小鼠肝癌细胞H22结合。前期有研究成功筛选出靶向FcγRⅢ(CD16α)分子的FcR适配体,该适配体能与DC表面的FcγRⅢ分子特异性结合。能否通过适配体增强融合细胞疫苗的抗肿瘤效果值得进一步研究。目的:探索一种基于双特异性适配体的新型融合细胞疫苗,为肿瘤细胞免疫治疗提供新的策略。方法:1.合成TLS11a/FcR双特异性适配体,流式细胞仪检测其与小鼠肝癌细胞系H22和BALB/c小鼠原代DC、小鼠肝正常细胞BNL.CL2的结合能力。用聚乙二醇(PEG)诱导两种细胞融合,制备双特异性适配体修饰的融合细胞疫苗TLS11a/FCR+PEG-DC/H22(TF@PEG-DC/H22)。2.流式细胞仪检测TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗表面共刺激分子CD80、CD86及抗原提呈分子MHC-Ⅱ类分子的表达水平;ELISA检测TF@PEG-DC/H22融合细胞培养上清液中细胞因子(IL-6、IFN-β、IL-12p70、IL-10)的水平。3.流式细胞仪检测T细胞经TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗刺激后表面活化分子CD25和CD69的表达水平;流式细胞仪检测T细胞经TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗刺激后的增殖情况;ELISA检测T细胞与TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗孵育后上清液中细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)的水平;ELISPOT检测T细胞经TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗刺激后分泌IFN-γ的阳性细胞频率。流式细胞仪检测T细胞经TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗刺激后对肝癌细胞H22、肝癌细胞Hepa1-6及小鼠正常肝细胞BNL.CL2的杀伤作用。4.HE染色检测融合细胞疫苗对正常小鼠各个脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)的细胞毒性。利用BALB/c小鼠构建荷肝癌移植瘤模型(H22模型),经TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗治疗3次后,通过测量小鼠瘤体重、体积大小,观察小鼠的生存率等指标评判融合细胞疫苗在体内的抗肿瘤作用。5.第三次治疗一周后眼球取血,ELISA检测小鼠血清IgG水平。取小鼠脾脏、骨髓、肿瘤组织制备细胞悬液,用流式细胞仪检测TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗治疗后的荷瘤小鼠脾脏细胞中调节性T细胞(Treg)的数量及脾脏、骨髓、肿瘤组织内骨髓来源的抑制细胞(MDSC)的数量。流式细胞仪检测小鼠脾脏T细胞对H22细胞的杀伤作用。6.当荷瘤小鼠瘤长度达15mm左右时取瘤做石蜡切片,免疫组织化学法检测荷瘤小鼠肿瘤局部血管密度(CD34抗原),检测荷瘤小鼠肿瘤细胞核抗原(PCNA)的表达;TUNEL法检测荷瘤小鼠肿瘤细胞的凋亡数量等实验探讨TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗的抗肿瘤机制。结果:1.流式细胞仪和荧光检测表明合成的双特异性适配体TLS11a/FcR能靶向结合小鼠肝癌细胞H22和小鼠原代树突状细胞DC。2.制备了双特异性适配体介导的新型DC/肿瘤融合细胞疫苗(TF@PEG-DC/H22),融合效率达60%。3.流式细胞仪检测结果显示TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗表面高表达共刺激分子CD80、CD86和抗原提呈分子MHC-Ⅱ类分子;ELISA检测结果显示TF@PEG-DC/H22融合细胞培养上清液中细胞因子(IL-6、IFN-β、IL-12p70)的水平升高,各组间IL-10的水平无差异。4.流式细胞仪检测结果显示TF@PEG-DC/H22能活化小鼠脾脏T细胞,使其表面活化分子CD25、CD69表达水平增高;TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗刺激的T细胞增殖能力更强;ELISA检测结果显示T细胞与TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗孵育后上清液中细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)的水平高于其他对照组。ELISPOT结果显示TF@PEG-DC/H22组分泌IFN-γ的T细胞频率比其他对照组高。TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗激活的T细胞能特异性地杀伤H22细胞,不杀伤肝癌细胞Hepa1-6及小鼠正常肝细胞BNL.CL2。5.HE染色表明TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗处理后的正常小鼠各主要脏器未发生明显器质性改变,无明显的毒副作用。BALB/c荷肝癌小鼠经TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗治疗后抑制肿瘤的生长,延长小鼠的生存时间。TF@PEG-DC/H22疫苗治疗荷瘤小鼠后血清中的IgG水平明显升高,小鼠脾脏Treg的数量明显降低,小鼠脾脏、骨髓及肿瘤组织中抑制性细胞(MDSC)的数量低于其他对照组。荷瘤小鼠脾脏中分离的T细胞能够特异性地杀伤H22细胞。6.免疫组织化学检测结果显示TF@PEG-DC/H22融合细胞疫苗能降低荷瘤小鼠肿瘤组织局部血管密度、抑制荷瘤小鼠肿瘤细胞核抗原的增殖、促进荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡。结论:本研究成功制备了双特异性适配体修饰的融合细胞疫苗TF@PEG-DC/H22,并在体内外产生了高效的抗肿瘤效应,为适配体用于肿瘤的细胞免疫治疗领域开辟新的思路和方向。