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FADD(Fas-associated death domain protein),最初是Dixit和Wallach两个研究小组利用Fas作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统,在HeLa细胞、人B淋巴细胞和鼠T淋巴细胞表达文库中筛选出的一种凋亡接头蛋白,在死亡受体(deathreceptors,DRs)介导的细胞凋亡通路中扮演着信息传递者的角色。近年来越来越多的研究表明,除了介导细胞凋亡外,FADD还参与了很多其它的生物学过程,如胚胎发育、细胞增殖、细胞周期、免疫系统、淋巴细胞激活、T细胞发育分化等。目前,FADD的非凋亡功能已经成为一个新的研究热点。 我们实验室及其他实验室前期研究表明T细胞特异性FADD缺失小鼠(CD4-Cre-FADD小鼠和Lck-Cre-FADD小鼠)和模拟FADD永久磷酸化的FADD(S191D)小鼠胸腺发育出现障碍。为了进一步探讨FADD在胸腺发育中所扮演的可能的生物学作用,我们用FADD作为诱饵蛋白,借助酵母双杂交系统,从小鼠的淋巴细胞文库中筛选与FADD相互作用的蛋白。在细胞内修复G∶T错配的胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)是筛选到的比较有意义的其中一个蛋白。免疫共沉淀分析进一步确定FADD与TDG能够在哺乳动物细胞发生相互作用,GST-pull down实验确认它们是直接的相互作用,并且TDG预先结合到包含G∶T错配的DNA链上能够增强它们的相互作用,免疫荧光实验确认在过表达体系下它们在细胞内能够相互招募和共定位。 在对TDG的性质、结构和功能研究中,一个特异的、有效的anti-TDG的抗体是不可缺少的,不幸的是我们先后从当时能够买到的两家公司购买的anti-TDG抗体均不能有效的使用,所以我们自己制备了高质量的TDG多克隆抗体,为我们下一步的实验奠定了必要的基础。 TDG是一个主要修复G∶T错配的DNA糖苷酶,它的活性分析对我们的研究是非常必要的,为了方便实验,我们发展了方便的基于光谱分析体系的,体外和细胞内定量测定DNA糖苷酶活性的测定方法。对于体外分析,没有放射性危害的荧光标记代替经典而且常用的同位素标记,结果显示,这种非放射性方法具有和同位素标记同样的敏感性和重复性。另外,我们设计了一个快速、简便的可以特异的和定量地测定细胞内DNA糖苷酶活性的测定方法,G/T错配被引入到pGL3-Control载体的luciferase的编码区上游,仅当G∶T错配被修复到G∶C时,luciferase才能够表达,通过测量luciferase的活性,它可以方便的评估DNA糖苷酶活性。 在确定了FADD与TDG的相互作用后,我们进一步探讨了它们相互作用的功能。我们首先确定了它们相互作用的结构域,结果表明与鼠FADD(mFADD)相互作用的鼠TDG(mTDG)的结构域是它的活性中心,包括氨基酸残基66-346;而mFADD的DED和DD之间的交联区包括氨基酸残基81-98对于mFADD与mTDG的相互作用是非常关键的。 TDG的体外测活实验表明,mFADD能够增加mTDG的G∶T错配修复活性。我们进一步探讨了FADD对细胞内负责修复G∶T错配的DNA糖苷酶活性的影响。结果表明,野生型的MEF细胞(FADD+/+)的DNA糖苷酶活性显著高于FADD-/-(p<0.01)和FADD(S191D)(p<0.01)的MEF细胞;在FADD-/-和FADD+/+的MEF细胞中过表达FADD,FADD(S191A),FADD(S191D)均能显著增加细胞的DNA糖苷酶活性(0.01<p<0.05),而FADD,FADD(S191A),FADD(S191D)之间没有差别。我们进一步证明FADD增加细胞内的G∶T错配修复活性是通过TDG和MBD4起作用。 我们进一步观察了FADD对胸腺、脾脏、淋巴结的TDG及TDG sumoylation水平的影响。结果表明胸腺的TDG sumoylation的比例非常高,脾脏次之,淋巴几乎没有;而且DN3-DN4期FADD开始缺失的CD4-Cre-FADD小鼠胸腺的TDGsumoylation明显降低,DN2-DN3期FADD开始缺失的Lck-Cre-FADD小鼠胸腺的TDG sumoylation降低得更加明显。FADD(S191D)小鼠胸腺的TDG sumoylation也明显降低。 TDG sumoylation是TDG在完成G∶T错配修复过程中必需的生物学事件,TDG sumoylation的降低意味着胸腺在完成G∶T错配修复方面可能存在障碍,所以我们分析了T细胞特异性FADD缺失小鼠和FADD(S191D)小鼠的胸腺细胞的G∶T错配修复活性。结果表明,CD4-Cre-FADD小鼠胸腺细胞的G∶T错配修复活性降低了大约49.4%,Lck-Cre-FADD小鼠降低了大约83.4%,FADD(S191D)小鼠大约降低了77.6%。 我们进一步通过流式分选,确定FADD影响胸腺TDG sumoylation的可能时期。结果表明,TDG sumoylation在双阳DP期最高,而T细胞特异性FADD缺失小鼠(CD4-Cre-FADD小鼠和Lck-Cre-FADD小鼠)和FADD(S191D)小鼠的TDG sumoylation在胸腺发育的每个时期都出现了不同程度的降低。 总之,FADD一方面影响了TDG的酶活,另一方面影响了TDG发挥生物学功能所必需的TDG sumoylation的发生。通过这两个方面,FADD在维系正常的G∶T错配修复的过程中具有重要作用,这很有可能是T细胞特异性FADD缺失小鼠和FADD(S191D)胸腺发育异常的原因之一。 TDG是一个重要的DNA糖苷酶,它主要修复5-甲基胞嘧啶自发水解脱氨基产生的G∶T错配。它修复G∶T错配的活性结构域被广泛而又粗略地认为是氨基酸残基67-374(小鼠),但没有被具体定义。通过对mTDG缺失变体的测活分析,我们对mTDG的G∶T错配修复活性的结构域进行了具体的界定,结果表明mDTG(135-309)是维持G∶T错配修复活性的所必需的最小的结构域,随后从生物信息学角度对我们界定的结构域进行了分析验证。