动脉粥样硬化是目前困扰人类的一大疾病。如何发现早期硬化斑块(脂纹)以及如何尽早采取干预措施,防止硬化斑块的进一步发展,甚至将已形成的斑块清除,是当前医药界的一个热点问题。在病理学方面,对动脉粥样硬化过程的研究已获得大量成果。其中较为肯定的是,炎症反应贯穿了动脉粥样硬化斑块形成的始终。硬化斑块早期的主要成分就是吞噬了大量脂质的巨噬细胞所形成的“泡沫细胞”(少部分泡沫细胞来源于平滑肌细胞)。减少泡沫细胞的生成,甚至促使已经形成的泡沫细胞内的脂质流出,就能够有效的防止斑块的进一步生成,并清除已经形成的早期斑块。 动脉粥样硬化的相关基因,近年来一直是分子病理学研究的重点。目前,已经有-些基因片段以及它们所调控的蛋白质与动脉粥样硬化病理过程之间的联系被证实。所以,基因治疗是一个被认为有着广阔前景的治疗方法。在基因治疗的众多方案中,最为直接的思路就是将某一段治疗基因片段输送至动脉硬化斑块内,并使其过度表达,促进某种蛋白合成,产生相应生物学效应,从而在基因水平上干预病程。在本实验中,我们选中的基因片段是B族清道夫受体I型(SR-BI)基因,通过过度表达SR-BI受体基因,使巨噬细胞(和巨噬细胞源性泡沫细胞)表面的SR-BI受体上调,从而促进细胞内脂质的流出；同时上调肝细胞的SR-BI,受体,促进高密度脂蛋白胆固醇酯(HDL)的脂质核心被肝细胞摄取、排泌,提高HDL残基水平,从而加速胆固醇逆转运,增强HDL效能,防治动脉粥样硬化发生、发展。将治疗基因输送至肝细胞内因肝细胞具有强大的吞噬功能而较易实现,但将基因片段有效的输送至硬化斑块内的巨噬细胞,则需要一个具有靶向性的药物输送系统才能得以实现。本试验就是利用新型纳米级造影剂超微超顺磁性氧化铁(USPIO)具有和巨噬细胞特异性结合的特性,将USPIO和脂质体相结合形成磁性纳米脂质体,输送SR-BI基因片段至动脉粥样硬化斑块内的巨噬细胞,通过磁共振技术加以监测,最后用分子生物学技术证实其能够在硬化斑块内高度表达,为基因治疗动脉粥样硬化寻求一种有效的、安全的给药系统。 目的: 探讨将靶向性造影剂USPIO与脂质体结合形成磁性纳米脂质体,携带SR-BI基因进入兔动脉硬化斑块内巨噬细胞并高度表达的可行性。 材料和方法: 一、建立动物模型 选55只新西兰大白兔作为实验动物,把它们分为空白对照组10只,实验组45只。空白对照组普通膳食。实验组通过单纯高脂喂养法建立动脉粥样硬化模型。分别于喂养前,高脂喂养后6周,9周测试实验组血脂。9周后,从空白对照组和实验组各随机选出10只兔,使用西门子产64层螺旋CT行CTA血管检查,西门子产1.5T磁共振CE-MRA血管成像。然后在检查过的两组兔中各随机选出5只,处死,结合病理验证影像学检查的可靠性。 二、实验用USPIO靶向性的检验 使用西门子产1.5T磁共振扫描仪在心电门控技术配合下对第一部分剩余的5只实验组兔进行注射USPIO前后扫描,序列为T1加权,T2加权,TOF-2D,部位为降主动脉。72小时后处死,将主动脉取出,福尔马林固定、石蜡包埋、切片,做普鲁士蓝染色。将空白对照组的剩余的5只兔注射USPIO后72小时处死,将主动脉取出,福尔马林固定、石蜡包埋、切片,做普鲁士蓝染色并与实验组对比。 三、目的基因的获取和扩增 根据基因序列和克隆载体(pGH)的信息,设计合成引物,使用PCR从兔肝组织中克隆目的基因,进行纯化和酶切克隆后,获得目的基因1100 μg(100 μ/ml)。 四、磁性纳米脂质体载药系统的制备 使用逆向蒸发法将500μg SR-BI与制备的脂质体结合成非磁性脂质体-DNA复合物。再将500μg SR-BI-与磁性纳米脂质体以相同的方法结合。 五、MR检验磁性纳米脂质体载药系统靶向性的实验、将制备的模型动物32只随机分为3组：对照组8只,实验组a12只,实验组b12只。经耳缘静脉将10ml葡萄糖水注入对照组,10m1脂质体-DNA复合物(含DNA40μg)注入实验组a,10ml磁性纳米脂质体-DNA复合物(USPI0-脂质体-DNA,含DNA40μg)注入实验组b。在注射前以及注射后即时、24小时、48小时、72小时对实验兔降主动脉行心电门控磁共振检查,序列为T1加权,T2加权,TOF-2D,并测T2加权图像中主动脉硬化斑块内的SNR值。72小时后,处死动物,取主动脉、肝脏、心脏福尔马林固定后切片,行HE,普鲁士蓝染色。 六、各组标本实时免疫定量PCR 将各组血管标本送-80℃液氮罐内冷储。根据SR-BI基因序列设计引物,进行实时免疫定量PCR。根据软件计算结果得出标本内SR-BI基因表达水平有无差异的结论,从而判定USPIO携SR-BI基因转染硬化斑块内巨噬细胞的效果。 结果: 一、动物模型 高脂喂养后6周、9周,实验组血脂各项指标较喂养前均显著升高,喂养后6周与9周血脂各项指标无显著差异。影像学检查显示所有实验组动物主动脉管壁均有凹凸不平表现,其分支颈总动脉和肾动脉亦有管腔轻度狭窄表现。空白对照组无此影像学表现。病理切片证实实验组动脉内膜增厚,内膜下大量泡沫细胞聚集,管腔狭窄；而对照组血管切片显示正常。 二、实验用USPIO靶向性的检验 从实验组中随机抽取5只兔,行MRI心电门控主动脉检查。注射USPIO前平扫T1加权、T2加权、TOF-2D。T1加权和T2加权见血管断面内新月形高信号沿管壁分布,脂肪抑制序列扫描后转为低信号。注射USPIO即时扫描T2加权血管管壁SNR信号显著下降。注射后24小时、48小时、72小时扫描T2加权斑块内SNR值持续下降。72小时后处死动物,病理普鲁士蓝大体染色显示斑块蓝染,镜下见内皮下含铁颗粒蓝染。空白对照组注射USPIO 72小时后处死,病理无此表现。 三、目的基因的获取和扩增 测序结果和理论序列比照分析,完全吻合的克隆为正确基因克隆。 四、磁性纳米脂质体载药系统的制备 用逆向蒸发法制备得到的磁性脂质体脂质体粒径分布在50-200nm,磁性脂质体-DNA复合物的粒径在200-400nm。当DNA与脂质体电荷比为1:7时具有最高包封率81.4％。不含USPIO的脂质体-DNA复合物及非磁性脂质体-DNA复合物粒径在150-300nm。 五、磁性纳米脂质体携目的基因靶向性效果测试实验： 对照组：注射前后扫描兔降主动脉,硬化斑块内T1加权、T2加权、2D-TOF信号无明显变化,T2加权SNR值无显著差异。注射后24小时、48小时、72小时血脂各项无明显变化。血管、肝脏、心肌病理切片普鲁士蓝染色阴性。心肌、肝脏HE染色见脂肪变性,血管HE染色见内膜增厚,内膜下大量泡沫细胞聚集。实验组a：注射前后扫描兔主动脉,硬化斑块内T1加权、T2加权、2D-TOF信号及T2加权SNR值无显著差异。注射后24小时、48小时、72小时血脂各项无明显变化。血管、肝脏、心肌病理切片普鲁士蓝染色阴性。心肌、肝脏HE染色见脂肪变性,血管HE染色见内膜增厚,内膜下大量泡沫细胞聚集。 实验组b：注射前后扫描兔主动脉,硬化斑块内T2加权信号SNR值较注射前显著下降,24小时、48小时和72小时T2加权信号SNR值显著下降。T1加权,T2加权横断位见血管壁内顺磁性物质沉积,TOF-2D MIP像见血管壁多量充盈缺损。注射后24小时、48小时、72小时血脂各项无明显变化。心肌病理切片普鲁士蓝染色阴性,肝脏肝细胞内见铁粒子蓝染,血管内皮下见少量含铁粒子蓝染。心肌、肝脏HE染色见脂肪变性,血管HE染色见内膜增厚,内膜下大量泡沫细胞聚集。 六、各组标本实时免疫定量PCR结果实验组a血管组织SR-BI基因表达的水平明显高于对照组。 实验组b血管组织SR-BI基因表达的水平明显高于实验组a。 结论: 本系列研究结果证实：治疗基因SR-BI能够被USPIO与脂质体结合形成的磁性纳米脂质体靶向性输送至动脉粥样硬化斑块内,并高度表达。