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背景:牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的奶牛养殖业重大损失的疾病。牛病毒性腹泻病原复杂,各型病毒交叉保护性差,目前缺乏有效的防治药物,同时也缺乏有效的疫苗。连翘酯苷A(ForsythiasideA,FTA)能够抑制BVDV复制,但具体的机制尚不清楚。目的:本研究的主要目的就是探究FTA抑制BVDV复制的具体机制,并制备BVDV DNA疫苗,评价免疫方式及其免疫效果。方法:从BVDV抗原和抗体均为阴性的牛外周血提取单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。以感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为 0.1 的 BVDV C24V株感染PBMCs,FTA添加浓度为100μg/mL,使用时与病毒同一时间点加入PBMCs中。病毒感染细胞的方法为无血清条件下加入病毒与PBMCs孵育1 h,而后加入10%的胎牛血清或FTA继续培养。扩增BVDV临床株E2基因,构建DNA疫苗。6～8周龄BALB/c小鼠150只,分为5组,分别进行三次免疫,分别免疫(100μLPBS;100μg空载体;100 μg pcDNA3.1-E2;40μgE2蛋白;pcDNA3.1-E2和E2蛋白)。第三次免疫后两周腹腔注射6×106TCID50病毒。用活细胞计数和绝对定量PCR分析FTA对BVDV复制作用的影响;用Real-time PCR及Western blot方法定量分析共刺激分子相对表达水平;用ELISA方法定量分析细胞免疫相关因子的表达和抗体效价测定;利用流式细胞术评价FTA对PBMCs增殖、活化和凋亡的影响;用免疫荧光、HE染色等方法评价疫苗对小鼠攻毒的保护作用。结果:FTA促进T细胞活化和增殖,抑制BVDV引起的PBMCs凋亡。FTA可以调节CD28/CTLA-4的表达水平,促进4-1BB在BVDV侵染过程中的表达,并在感染24 h后提高TRAF-2的表达。FTA可以提高BVDV侵染过程中的IgG2a和IL-2表达,并调节IFN-γ的过度分泌。FTA能够抑制BVDV在每个PBMC中的拷贝数目,且不影响病毒毒力。制备BVDV E2真核表达载体pcDNA3.1-E2,并进行转染和体外表达鉴定。同ISA61佐剂混合后制备的DNA疫苗和亚单位疫苗免疫小鼠能够激发较高水平的抗体水平,促进CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+T细胞的表达,提高血清中IL-4的浓度,可以减轻BVDV引起的小鼠组织损伤,攻毒后疫苗组小鼠脾脏、肺脏和肾脏的病理变化明显轻于攻毒对照组。DNA疫苗免疫可以促进脾脏淋巴细胞增殖。制备的DNA疫苗和亚单位疫苗采用prime boost的策略免疫小鼠,能够产生较高水平的中和抗体,主要的抗体亚型为IgG1、IgG2b和IgG2a。同时能够激发有效的CTL以及Th1和Th2细胞免疫反应,促进IL-4分泌,有效的保护小鼠抵抗BVDV感染。结论:FTA具有抗BVDV感染作用,部分通过抑制BVDV的复制和PBMC的凋亡以及促进T细胞的激活。抗病毒机制可能与TRAF2依赖性CD28-4-1BB信号传导有关。采用联合免疫DNA疫苗和亚单位疫苗及采用prime boost免疫策略能够有效提高机体免疫反应的强度。