第一部分:免疫相关性全血细胞减少症患者NK细胞数量功能研究目的检测免疫相关性全血细胞减少症(IRP)患者外周血自然杀伤(nature killer,NK)细胞数量和功能。背景免疫相关性血细胞减少症(IRP)是由于某种原因导致机体产生抗骨髓造血细胞自身抗体,使机体正常的造血功能受到破坏(抑制),临床主要表现为不同程度的贫血、出血、感染。自然杀伤细胞(nature killer cell,NK cell)是外周血大颗粒淋巴细胞,是机体固有免疫的重要组成部分,其通过分泌细胞因子和(或)发挥细胞毒性作用来清除病原体和肿瘤细胞。近年来,有文献报道NK细胞在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮[1](systemic lupus erythematosus,SLE)、类风湿性关节炎[2](rheumatoid arthritis)中存在数量和功能异常,且多数研究认为NK细胞在自身免疫性疾病中主要起保护作用,具体机制尚不明确,本研究用流式细胞术检测IRP患者外周血NK细胞数量和功能,并把结果与患者临床和免疫指标做相关性分析。材料与方法用单克隆抗体四标法和流式细胞术(FCM)检测42例IRP患者(初治组20例,缓解组22例)外周血NK细胞(CD3-CD56+)及其亚群(CD3-CD56brightCD16-)(CD3-CD56dimCD16+)占淋巴细胞百分比、NK细胞激活性受体(NKG2D、NKp46和NKp44)、NK细胞抑制性受体(CD158a和CD158b)及NK细胞胞浆穿孔素、颗粒酶-β的表达,并与12名健康人(对照组)做比较。把上述数据与IRP患者外周血血红蛋白、血小板、中性粒细胞比例(ANC%)、网织红细胞比例(Ret%)、患者血清免疫球蛋白水平Ig G和Ig M、补体C3、补体C4、胆红素、乳酸脱氢酶水平以及患者B细胞亚群、T细胞亚群和DC细胞亚群做相关性分析。结果1.IRP患者外周血NK细胞及其亚群的占淋巴细胞百分比的变化(1)IRP患者NK细胞百分比的变化初治组、缓解组、对照组NK细胞占淋巴细胞百分比分别为(10.04±5.33)%、(11.62±6.80)%、(19.94±7.38),初治组和缓解组较健康人显著减少(p<0.05),初治组和缓解组相比没有统计学意义(p>0.05)。(2)IRP患者NK细胞亚群CD56brightCD16-在初治组、缓解组IRP患者和对照组的百分比中位数分别为0.35、0.64、1.31,其中初治组显著少于对照组(p<0.05)。初治组与缓解组,缓解组与对照组相比没有统计学意义(p>0.05)。(3)IRP患者NK细胞亚群CD56dimCD16+在初治组、缓解组IRP患者和对照组的百分比分别为(9.20±5.22)%、(10.31±7.18)%(17.23±6.94)%,初治组和缓解组显著少于对照组(p<0.05),初治组和缓解组相比没有统计学意义(p>0.05)。2.IRP患者外周血NK细胞表面受体的表达(1)激活性受体NKG2D在初治组、缓解组IRP患者和对照组NK细胞表达分别为(74.03±18.24)%、(45.97±29.45)%、(41.89±15.34)%,初治组IRP患者NKG2D表达显著高于缓解组和对照组(p<0.05),缓解组和对照组相比没有统计学意义(p>0.05);激活性受体NKp46在初治组、缓解组IRP患者和对照组NK细胞表达率分别为(67.14±16.80)%、(74.98±18.39)%、(68.06±19.57)%,相互比较没有统计学意义(p>0.05);激活性受体NKp44在初治组、缓解组IRP患者和对照组NK细胞表达率中位数分别为0.58、0.71、0.40,相互比较没有统计学意义(p>0.05)。(2)抑制性受体CD158a在初治组、缓解组IRP患者和对照组NK细胞表达率中位数分别为3.72、16.10、11.04,初治组IRP患者CD158a表达率显著低于缓解组和对照组(p<0.05),缓解组和对照组相比没有统计学意义(p>0.05);抑制性受体CD158b在初治组、缓解组IRP患者和对照组NK细胞表达率中位数分别为22.65、8.11、20.69,相互比较没有统计学意义(p>0.05)。3.IRP患者外周血NK细胞胞浆蛋白穿孔素、颗粒酶-β表达穿孔素在初治组、缓解组IRP患者和对照组NK细胞表达率分别为(75.71±10.14)%、(77.88±22.82)%、(60.22±14.58)%,初治组和缓解组显著高于对照组(p<0.05),初治组和缓解组相比没有统计学意义(p>0.05);颗粒酶-β在初治组、缓解组IRP患者和对照组NK细胞表达率分别为(83.22±13.78)%、(85.58±12.96)%、(82.07±19.27)%,三组相互比较没有统计学意义(p>0.05)。4.IRP患者NK细胞比例、受体与临床指标和免疫指标做相关性分析1 NK细胞比例、受体胞浆蛋白表达率与患者临床指标做相关性分析NK细胞穿孔素表达率与血红蛋白水平呈正相关(r=0.452,p<0.01),NK细胞比例、受体与IRP患者外周血血红蛋白、血小板、中性粒细胞比例(ANC%)、网织红细胞比例(Ret%)无相关性(p>0.05);NK细胞比例、受体与IRP患者血清免疫球蛋白水平Ig G和Ig M、补体C3、补体C4、胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)水平无相关性(p>0.05)。2 NK细胞比例、受体胞浆蛋白表达率与患者免疫指标做相关性分析NK细胞比例与患者B细胞亚群(CD5+CD19+/CD19+)呈正相关(r=0.487,p<0.05),NK细胞比例与T细胞亚群(CD3+CD4+/CD3+CD8+)比值无相关性(p>0.05),NK细胞比例与树突细胞(DC)亚群浆细胞样树突细胞(p DC)和髓系树突细胞(m DC)比值(Lin-HLA-DR+CD123+/Lin-HLA-DR+CD11c+)无明显相关性(p>0.05);NK细胞与骨髓单个核细胞膜抗体(BMMNC-Ab)CD15+细胞Ig G和Ig M阳性率、Glyco-A+细胞Ig G和Ig M阳性率、CD34+细胞Ig G和Ig M阳性率均无明显相关性(p>0.05)。结论IRP患者体内NK细胞数量减低,免疫监视作用减弱,不能维持免疫系统的稳态,免疫细胞功能亢进,导致发病。因此NK细胞很可能发挥了保护性作用,而NK细胞激活性受体表达增加,抑制性受体表达减少,胞浆蛋白增多可能是对于NK细胞数量减少的代偿。第二部分:免疫相关性全血细胞减少症患者NK细胞Tim-3分子表达的研究目的检测免疫相关性全血细胞减少症(IRP)患者外周血自然杀伤(nature killer,NK)细胞Tim-3分子表达情况。材料与方法用流式细胞术(FCM)检测29例IRP患者(初治组15例,缓解组14例)外周血NK细胞表面(CD3-CD56+)Tim-3分子的表达,并与12名健康人(对照组)做比较。用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞,用免疫细胞磁珠分选的方法分选富集NK细胞,提取总RNA,逆转录,用Real Time PCR技术检测NK细胞Tim-3分子m RNA的水平。结果1.流式细胞术(FCM)方法检测IRP患者外周血NK细胞表面Tim-3的表达(1)Tim-3在NK细胞(CD3-CD56+)上在初治组、缓解组和对照组的表达分别为(70.10±13.87%)(88.95±9.84%)(85.62±9.03%),其中初治组Tim-3的表达率显著少于缓解组和对照组(p<0.05),缓解组和对照组相比没有统计学意义(p>0.05)。(2)Tim-3在CD56brightCD16-NK细胞亚群上的表达率在初治组、缓解组和对照组的表达分别为(71.85±24.83%)(78.62±27.20%)(62.64±12.06%),虽然初治组和缓解组有升高趋势,但三组间比较没有统计学意义(p>0.05)。(3)Tim-3在CD56dimCD16+NK细胞亚群上的表达率在初治组、缓解组和对照组的表达分别为(71.58±14.10%)(89.32±9.27%)(83.83±10.59%),初治组表达率显著少于缓解组和对照组(p<0.05),缓解组和对照组相比没有统计学意义(p>0.05)。2.免疫细胞磁珠分选计数分选外周血NK细胞用免疫细胞磁珠分选的方法成功分选出外周血NK细胞(CD3-CD56+),分选纯度达到96.54%。3.Real Time PCR方法检测Tim-3的表达实时定量PCR检测Tim-3分子m RNA水平在初治、缓解组和对照组分别为(0.76±0.11)(3.76±2.53)(1.03±0.25),其中初治组Tim-3分子m RNA表达水平显著低于缓解组和对照组(p<0.05),缓解组Tim-3分子m RNA表达水平显著高于对照组(p<0.05)结论通过免疫细胞磁珠分选法可以纯化富集NK细胞,分选纯度可达96.54%;初治组IRP患者NK细胞(尤其是CD56dimCD16+NK细胞亚群)Tim-3表达显著少于缓解组患者和对照组,说明NK细胞功能在体内环境下可能存在激活现象,并有较强的细胞毒作用,这可能参与了IRP的发病。但是具体机制和意义尚不明了,需深入研究。