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作为一种模式生物，斑马鱼被广泛应用于发育生物学、分子生物学、遗传学、毒理学、病理学及免疫学等领域的研究。本文通过建立金黄色葡萄球菌感染前后的斑马鱼淋巴细胞cDNA文库和探索斑马鱼基因打靶技术来研究斑马鱼的免疫。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是临床上一种常见的引起炎症反应的病原微生物，我们通过两次腹腔注射感染斑马鱼，建立了S.aureus-斑马鱼感染模型，从而为研究S.aureus的致病机理和探索斑马鱼免疫防御机制打下了基础。用传统的Ficoll-Paque Plus试剂，从斑马鱼全血中分离出高纯度的淋巴细胞，应用SMART cDNA Library Construction技术，构建以真核表达载体pcDNA3为基础的cDNA表达文库。对于正常的斑马鱼淋巴细胞cDNA文库(Drlym)已测得4261 ESTs序列并拼接成2742clusters，对于S.aureus感染的斑马鱼淋巴细胞cDNA文库(Drjflym)已测得6988 ESTs序列并拼接成5334 clusters。通过对感染前后文库中与免疫应答或抗感染信号途径有关的序列及与其它高等脊椎动物(小鼠和人)比较表明，斑马鱼的免疫应答和抗感染机制与小鼠及人有较高的保守性。比如在斑马鱼Driflym文库中发现IL-10受体、TNF及其受体和CD40等分子相应高表达，显示了在斑马鱼中也可能同样存在完整的IL-10抗感染信号通路。另外，在Driflym中还发现了一系列CD分子的高表达，其中的一些还是首次在斑马鱼中发现，如CD2、CD9、CDl8、CD53、CD40及CD84等。通过对感染前后两个文库的比较表明，S.aureus有能力激活斑马鱼淋巴细胞的增殖、分化和启动一些相关基因的表达。
在对两个cDNA文库的ESTs序列分析中，分别发现了两个新的免疫型受体基因(Novel immune-type receptor，nitr)，分别命名为nitr13(Drlym)和nitr14(Driflym)。nitr13定位于斑马鱼第22号染色体上，含有3个外显子和2个内含子，通过Blast对斑马鱼基因组的搜索及用Genscan对其基因组序列的分析结果表明，在nitr13的5’端上游还存在4个与nitr13的IGv结构域(domain)高度同源的编码IGv序列(V1、V2、V3和V4)，但其中的V4发生了琥珀(TAG)突变提前终止了。在nitr13的3’端下游也存在2个编码IGv序列(V6和V7)。把这7个IGv序列建立系统发生树，分析结果表明，它们来自同一个祖基因的两次复制。通过Southern杂交结果分析表明，nitr13在基因组里只有一个分子拷贝(copy)，Northern杂交结果表明在受检测的各组织中都有表达，只是表达水平有差异，在鳃里有较高表达。同样，nitr14通过与斑马鱼基因组的比对，被定位于第16号和第14号染色体上，具有4个分子拷贝，与Southern杂交结果一致。Northern杂交结果表明NITR14在斑马鱼鳃中表达水平最高，在肾、肠和脾脏中也有较高表达，在精巢和心脏中表达水平较低，而在其他样品组织中没能检测到表达，表明NITRl3和NITR14可能参与先天性免疫反应。
另外，本文还探讨了利用斑马鱼单胞期(1-cell)受精卵为直接基因打靶(Genetargeting)载体注射材料，再加上两种荧光蛋白(EGFP／DsRFP)作为正负筛选标记，探索出一种在斑马鱼中成功进行基因打靶的技术方法。考虑到可行性和基因研究背景等因素，我们选择了用斑马鱼B-actin启动子序列置换斑马鱼生长激素(Growth hormone，GH)启动子序列。为此构建了两个打靶载体pGHT1.7k和pGHT2.8k，并对它们分别显微注射斑马鱼受精卵。在实验中还发现虽然pGHT2.8k的阳性率比pGHT1.7k稍高，但其致死率也较高。利用绿色荧光和红色荧光蛋白作为筛选标记，挑出只发绿色荧光的胚胎并养到成鱼后使其与野生型斑马鱼杂交，从而筛选出绿色荧光标记的F1代，大约有2.5％的P0代可以遗传绿色荧光蛋白，再对F1代进行Southern杂交进一步鉴定。P0代不能遗传绿色荧光蛋白的P0代也用PCR和Southern杂交分析。最终统计的阳性打靶结果为1.7E-6。
总之，我们的结果显示在结构和功能上斑马鱼的免疫系统和调控机制和其他高等脊椎动物相比具有高度的保守性，是一个用于研究先天性和后天性免疫系统的良好的模型。通过对斑马鱼GH启动子置换的实验结果表明，双荧光筛选策略在斑马鱼基因打靶中是可行的，同时证明了斑马鱼单胞期受精卵可以作为打靶载体直接的受体。