研究背景藏猪(Tibet hog,Sus scrofa)是世界上体型较小的小型猪之一,原产于青藏高原、海拔2500～4300m的农区和半农半牧区,分布于中国的西藏自治区、云南省、四川省和甘肃省等地。藏猪保存了较为纯正的品种资源,是唯一能够适应高海拔气候和以放牧为主的猪种。由于长期的地理隔离和环境的差异,不同地区的藏猪出现了一定程度的分化,如四川藏猪与云南藏猪相比,四川藏猪偏离Hardy-Weiberg定律的基因座数多于云南藏猪;四川藏猪体型较小,而云南减猪体型较大。目前虽然对四川藏猪或云南藏猪开展了一些研究,但对于来自西藏自治区的藏猪研究报导较少。2004年南方医科大学从西藏自治区工布江达县将50头藏猪(雌、雄各半)引种到广州,首次开展对藏猪进行实验动物化的培育,并将其命名为西藏小型猪(Tibet mini-pig)。2006底获得广东省实验用西藏小型猪生产质量合格证,目前存栏数已达600余头。目的测定西藏小型猪的mtDNA控制区序列和Cyt b基因序列,研究西藏小型猪mtDNA控制区和Cyt b基因序列的遗传分化,及其对血液生理生化指标的影响,并和其他猪的序列比对分析,研究其亲缘关系;探讨西藏小型猪氟烷基因座位的群体结构特征,检测氟烷基因型隐性纯合子个体,寻找西藏小型猪独特的分子遗传标记,从理论上指导西藏小型猪实验动物化的培育。方法1随机抽取120头西藏小型猪血液,利用试剂盒提取血液基因组DNA;设计引物扩增西藏小型猪以及7头巴马小型猪、23头贵州香猪和17头五指山猪的mtDNA控制区,测序并结合Clustalw软件和MEGA3.0软件进行所测序列多重比对,确定变异位点、单倍型,并建立西藏小型猪和国内其他猪的亲缘关系树。对其中58头8月龄的西藏小型猪分别测定血液生理生化指标。血液生理指标14项:白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血细胞比容、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、平均红细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度。血液生化指标11项:谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶与谷草转氨酶比值、总蛋白、碱性磷酸酶、葡萄糖、尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、白蛋白。分类后进行指标的比较。统计学分析采用SPSS13.0版统计学软件进行两个样本的t检验,所有数据以均数±标准差((?)±SD)表示。2以代表mtDNA控制区5′端序列单倍型的西藏小型猪和部分巴马小型猪、贵州香猪、五指山猪的全基因组DNA为研究对象,设计引物扩增四种小型猪的Cyt b基因序列,测序后利用MEGA3.0软件进行碱基序列和氨基酸序列比对,建立亲缘关系树,分析西藏小型猪的进化地位。3应用PCR-RFLP技术,研究西藏小型猪的氟烷基因多态性。以杜洛克猪和长白猪基因组样本为对照,用特异性引物扩增3个猪种的氟烷基因片段,然后进行限制性内切酶(HhaⅠ)酶切以及酶切结果的鉴定,通过基因型辨读,获得群体的基因型频率特征数据,确定隐性纯合子基因型个体。对酶切电泳结果进行辨读时,HAL~NHAL~N基因型表现出493bp和166bp两条电泳条带,HAL~NHAL~n基因型表现出659bp、493bp和166bp三条电泳条带,HAL~nHAL~n基因型只出现659bp一条电泳条带。结果1前人的研究表明,猪的mtDNA控制区的串联重复区存在长度异质性(15—29个重复片段),重复片段全部是:GTACACGTGC,称之为完全重复。但是本研究显示,西藏小型猪不仅有完全重复(A型),而且有不完全的重复(B型),即一部分西藏小型猪10bp的重复片段不仅有GTACACGTGC,而且还有GTACACATGC和GTACACGTAC这两个片段及其交替排列现象。系谱分析显示,这种排列类型同样按母系遗传方式由母本传给后代,与父本没有关系。西藏小型猪mtDNA控制区3′端侧翼区为340bp,变异位点少,与国内其他家猪的序列一样比较保守;5′端侧翼区704bp,有20个变异位点,由此归纳出26个单倍型。西藏小型猪5′端侧翼区三个转换位点(305,500,691)的变化几乎与串联重复序列所分的A、B两组类型相对应:B型中三个变异位点的碱基分别为t,a,a(100%);A型中三个变异位点的碱基分别是c,g,g的占87%,其他13%。与西藏小型猪相比,巴马小型猪、贵州香猪和五指山猪mtDNA控制区5′端变异位点较少,分别只有4、4、3种单倍型,串联重复区也只有一种类型,A型。对西藏小型猪A型和B型群体与血液生理生化特性的进行相关分析,结果表明A型和B型群体血液红细胞数量有显著性差异(A型＜B型,P＜0.05)。2利用控制区5′端侧翼区序列归纳出的单倍型建立亲缘关系树的分析表明,西藏小型猪与中国地方家猪有较近的亲缘关系,特别与中国西南地区几种家猪的亲缘关系最近。3西藏小型猪与国内家猪的Cyt b基因序列几乎相同;与欧洲猪相比差异较大,共有16个主要变异位点,其中有两个特殊转换位点:420位点T—C转换和883位点的G—A转换,几乎各占一半。利用Mege3.0软件将碱基序列转换为氨基酸序列后的分析表明,西藏小型猪与国内其他猪有一个氨基酸位点(295位点)、与欧洲猪有三个氨基酸位点(89,295,314位点)存在着差异。在295位点,大部分A型西藏小型猪与欧洲猪同为缬氨酸(Ⅴ),而B型和少部分A型为异亮氨酸(Ⅰ)。巴马小型猪、五指山猪和贵州香猪的氨基酸序列在295位点也为异亮氨酸(Ⅰ)。结果进一步证实,西藏小型猪群体内存在分化,mtDNA控制区的序列变异与功能基因的结构变化存在一定相关性。4 120头西藏小型猪个体氟烷基因型全部为HAL~NHAL~N,没有发现应激敏感基因,氟烷基因显性纯合子基因型:HAL~NHAL~N的频率为100%;HAL~NHAL~n型和HAL~nHAL~n型均为0。而在杜洛克猪样本中检测到4份杂合子样本,长白猪样本中检出1份杂合子个体,但都没有发现隐性纯合子个体。西藏小型猪群体内未发现应激敏感性的隐性基因,整个群体抗应激能力强。结论1根据西藏小型猪mtDNA控制区串联重复区的长度和重复片段存在异质性,可将西藏小型猪群体分为A型和B型。A、B类型和5′端的三个碱基转换位点:305,500,691,可以联合组建西藏小型猪的遗传标记。建议通过人工选择,A型B型分为两个群体,淘汰A型中少量变异个体(13%),强化西藏小型猪的标记,培育成两个封闭群体:B型三个转换位点分别为t,a,a;A型封闭群的三个转换位点纯化为c,g,g。2由于西藏小型猪串联重复区的排列类型A型或B型都可以由母本传给后代,而目前所报导的国内家猪全部为A型,没有B型的报导,因此提出A型西藏小型猪和其他中国家猪有共同起源,B型可能是基因突变或者是两种母系起源的结果。3西藏小型猪Cyt b基因的全序列有两个转换位点,与A型和B型西藏小型猪有一定对应关系。利用Mege3.0软件将碱基序列转换为氨基酸序列后的分析表明,西藏小型猪Cyt b第295位氨基酸大部分为缬氨酸(Ⅴ),而少部分为异亮氨酸(Ⅰ)。其他国内家猪的氨基酸序列全部为异亮氨酸(Ⅰ)。结果进一步证实,在西藏小型猪群体内存在分化。4西藏小型猪群体氟烷基因,未发现应激敏感性的隐性基因,说明西藏小型猪的应激敏感性比较低,适合于开展外科手术或器官移植等实验研究。