研究背景：　　 膀胱癌是我国泌尿男生殖系统最常见的恶性肿瘤[1]。随着工业污染的增加，膀胱癌的发病率逐年上升，从1985年至2005年，每年新诊断膀胱癌人数增加50％，已经成为严重影响人们健康的常见的恶性疾病[2]。膀胱癌75-85％为浅表性肿瘤，经尿道电切(TURBt)及术后膀胱灌注化疗或免疫治疗是主要治疗方式，但仍然有14-45％最终发展为浸润性膀胱癌[3]。浸润性膀胱癌的治疗以手术切除为主[2]，但手术创伤大、并发症多、5年生存率较低(54.5-68％)[3,4]。且膀胱癌具有容易复发，易转移特点。到目前为止，仍无特异性生物标志物和治疗靶点，且膀胱癌形成的机制尚未完全阐明，这也使膀胱癌的治疗更为困难。进一步研究膀胱癌发病分子机制，发现新的有效的治疗手段，具有重要的科学意义。　　 膀胱癌形成和外界致癌物质刺激、尿路上皮微环境敏感性密切相关。在致癌物质刺激下，膀胱细胞DNA产生损伤，启动并促进膀胱肿瘤形成。在这过程中癌基因及抑癌基因起着重要的作用。近年来，microRNAs在肿瘤中的异常表达及其在肿瘤中的作用阐明，表明microRNAs在肿瘤中起到癌基因或抑癌基因的作用[5-7]。　　 MicroRNAs(miRNAs)是一类含有19-22个核苷酸、内源性、非编码的短链RNA，其主要功能是对基因进行转录后调控。miRNA结合靶基因3'端非转录区(3'-UTR)并通过降解靶基因或抑制靶基因翻译来实现转录后的基因沉默(PTGS)[8]。在人类基因组中，miRNAs调控大约1/3的蛋白编码基因，并调控细胞的凋亡、增殖、分化、发育、代谢等[9,10]。　　 据报道，miRNA异常表达存在于多种肿瘤中，包括：淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌、泌尿系肿瘤等[4]。miRNA通过调控下游靶基因，在肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因的功能[11]。　　 在我们前期研究中[12]，通过microRNA芯片技术检测膀胱癌组织和癌旁组织中miRNA差异表达，发现膀胱癌组织中miR-143和miR-125b表达明显降低，进一步Real-time PCR检测表明，与癌旁组织相比，miR-125b是膀胱癌组织下调最明显的miRNA之一。以上结果提示miR-125b是膀胱癌差异表达最明显microRNA之一，可能在膀胱癌发病机制中起重要作用。然而，miR-125b在膀胱癌中的具体生物学功能尚不清楚。因此有必要对miR-125b在膀胱癌中的作用机制进行研究。　　 研究目的：　　 1.研究miR-125b对膀胱癌生物学行为影响，确定膀胱癌中miR-125b是否起着重要的抑癌基因作用，是否由于miR-125b缺失导致膀胱癌的发生、发展。　　 2.鉴定miR-125b调控的下游靶基因，分析并提出由于miR-125b缺失导致膀胱癌的发生、发展的作用途径。　　 材料与方法：　　 1.检测膀胱癌组织和正常膀胱组织、膀胱癌细胞株中miR-125b的表达情况。　　 通过Nothern blot检测膀胱癌细胞株T24、5637、J82和UM-UC-3，3对膀胱癌组织及癌旁组织中miR-125b的表达情况。通过Real-time PCR检测22例膀胱癌组织和10例正常膀胱上皮组织中miR-125b表达情况。　　 2.观察miR-125b对膀胱癌细胞生物学行为影响。　　 体外转染miR-125b后，分别通过细胞计数、MTT实验、体外克隆形成实验检测膀胱癌细胞株T24，5637细胞增殖能力的改变；通过流式细胞技术检测细胞周期的改变；体内裸鼠成瘤实验，分为miR-125b组和NC组，每组5只，检测转染miR-125b或NC(Negative Control miRNA)后膀胱癌细胞体内成瘤能力的改变。　　 3.鉴定miR-125b调控的下游靶基因。　　 靶基因预测软件PicTar和TargetScans预测miR-125b在膀胱癌中的潜在靶基因E2F3。分别构建含有E2F3基因的3'端非编码区序列E2F33'-UTR(E2F3-WT)和突变序列E2F3-3'-UTR(E2F3-MUT)的荧光素酶报告载体psiCHECK-2-3'-UTR-WT和psiCHECK-2-3'-UTR-MUT，通过共转染psiCHECK-2-3'-UTR-WT/MUT载体和miR-125b或NC miRNA，检测荧光素酶活性强度，验证软件预测结果。转染miR-125b后，采用RT-PCR及Western blot检测潜在靶基因E2F3蛋白及mRNA的表达变化，进一步通过RT-PCR检测靶基因E2F3下游基因表达改变，进而阐明miR-125b及其靶基因在膀胱癌中的可能的作用机理。　　 结果：　　 1.Northern blot检测结果表明，在癌旁组织中miR-125b高表达，而在膀胱癌组织以及膀胱癌细胞株中miR-125b低表达(p＜0.01)。Real-time PCR检测结果表明：相比10正常膀胱上皮组织，22例膀胱癌组织中miR-125b表达显著下调(p＜0.01)。　　 2.细胞计数实验和细胞活力检测表明miR-125b显著抑制膀胱癌细胞株T24，5637的增殖能力(p＜0.01)。流式细胞技术检测结果：转染miR-125b后，处于细胞周期G1期的细胞显著增加，而S期的细胞显著减少(p＜0.01)。体外克隆形成实验中，miR-125b可以抑制膀胱癌细胞株T24和5637形成克隆的数目和大小(p＜0.01)。体内裸鼠成瘤实验中，转染miR-125b的5637细胞成瘤数目及肿瘤体积均下降(miR-125b转染组5只裸鼠中有2只成瘤，NC转染组5只裸鼠全部成瘤，miR-125b转染组的肿瘤体积较NC转染组减小，p＜0.05)。　　 3.PicTar和TargetScans软件预测E2F3可能是miR-125b的潜在靶基因，E2F3基因3'非转录区(3'-UTR)包含了miR-125b的互补结合位点。荧光素酶报告基因分析结果表明：在转染miR-125b和NC后野生型E2F3(E2F3-WT)的荧光报告载体的荧光强度受到显著抑制(p＜0.001)，而突变型E2F3(E2F3-MUT)基因的荧光报告载体的荧光强度基本不受影响。　　 4.转染miR-125b后，采用Western blot及RT-PCR检测潜在靶基因E2F3的表达情况，发现E2F3蛋白受到抑制，而E2F3 mRNA不受影响。转染miR-125b后，采用RT-PCR检测E2F3下游基因的表达，发现CyclinA2 mRNA表达下调。　　 结论：　　 1.miR-125b在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24，5637，J82和UM-UC-3中低表达，在正常膀胱上皮组织中高表达。　　 2.miR-125b抑制膀胱癌细胞的增殖能力。　　 3.E2F3癌基因是miR-125b潜在靶基因。miR-125b可能通过作用于其潜在靶基因E2F3，抑制E2F3蛋白的表达，调控E2F3-Cyclin A2信号通路，从而发挥抑癌基因作用。