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研究背景苯和甲醛均是工业生产中重要的生产原料,广泛存在于建筑材料和居室装修材料中。近年来,随着人们生活水平不断提高,室内装饰成为时尚,室内空气苯和甲醛污染状况日益严重。由于人的大部分时间是在室内度过,因此其对人体健康的危害不容忽视。苯和甲醛导致妊娠失败、出生缺陷和婴儿死亡等妊娠结局的不良影响已引起广泛关注。已有流行病学研究表明,苯或甲醛单独暴露对女性月经周期和生殖机能具有一定影响。动物实验研究显示,苯或甲醛均具有一定的胚胎毒性。居室装修后室内环境中苯和甲醛等污染物常同时存在,但目前尚缺乏其联合暴露时对胚胎发育影响的研究报道。此外,不同生殖阶段暴露于苯或甲醛所引起的胚胎毒性效应及其反应程度可能存在一定差异。本研究采用析因设计安排苯和甲醛联合暴露剂量,在小鼠卵泡发育期和胚胎植入期不同生殖阶段染毒,探讨其胚胎毒性。研究目的探讨小鼠卵泡发育期和胚胎植入期苯与甲醛联合暴露对胚胎植入与植入后胚胎发育的影响及可能存在的联合毒性;比较不同生殖阶段暴露于环境毒物致胚胎毒性的敏感生殖阶段阶段;通过检测小鼠卵巢组织细胞DNA-蛋白质交联程度进一步观察胚胎植入障碍卵巢与DNA损伤程度之间的关系,为居室装修后室内环境污染物的生殖毒性评价提供理论依据。研究方法1.建立卵泡发育期和胚胎植入期苯与甲醛联合暴露致小鼠胚胎毒性的动物模型（1）实验设计:采用两因素四水平的析因设计方法安排动物暴露剂量组合。苯和甲醛是其中两个研究因素,各设四个剂量水平,分别为（0、0.875、8.75、87.5）mg/kg和（0、7.875、15.75、31.5）mg/kg。（2）暴露设计:暴露时间:卵泡发育期暴露是在小鼠交配前3d连续染毒,胚胎植入期暴露是在孕4d-6d连续染毒。按照设计剂量1次/d,连续3d。暴露方式:经腹腔注射染毒。根据孕鼠染毒当天体重调整苯和甲醛用量。（3）促排卵处理:雌性小鼠腹腔注射10U孕马血清（PMSG）,48h后腹腔注射10U人绒毛膜促性腺激素（HCG）,按雌雄1∶1交配合笼,次日检查阴栓。查到阴栓日作为孕第1天记为D1,连续三天合笼无阴栓者弃之。（4）观察指标:小鼠孕期体重;D9小鼠肝、脾、肾、子宫、卵巢重量;植入胚胎数目,植入胚胎总重量。（5）分析方法:SPSS 13.0建立数据库;首先对各指标进行方差齐性检验。方差齐性时,进行析因设计的F检验;方差不齐性时,采用非参数秩和检验。统计学检验水准设为α=0.05。2.卵巢组织细胞DNA-蛋白质交联实验分离和裂解卵巢组织细胞,KCL-SDS沉淀法分离组织细胞中游离DNA和DNA-蛋白质交联（DPC）中的DNA。加入荧光染料Hoechst33258,阴暗处反应后采用F-4500型荧光分光光度仪在350nm激发光和450nm发射光下测定各样品荧光值。根据标准曲线定量交联DNA和自由DNA,计算DPC系数。DPC系数统计分析方法同前。3.胚胎植入障碍与卵巢组织细胞损伤之间的关联性分析采用Spss13.0软件包综合分析苯与甲醛联合暴露后对卵巢组织细胞DPC、卵巢重量及胚胎植入数目的影响,采用pearson相关计算DPC与卵巢重量、胚胎植入数目间的相关系数。统计学检验水准设为α=0.05。研究结果1.小鼠卵泡发育期和胚胎植入期苯与甲醛联合暴露的胚胎毒性（1）卵泡发育期暴露组,甲醛明显减少胚胎植入数目和植入胚胎总重量（P分别为0.02和0.00）,小鼠卵巢和子宫重量明显下降（P分别为0.00和0.05）;各剂量苯暴露组未显示明显的胚胎和母体毒性（P均大于0.05）;苯和甲醛联合暴露时,对卵巢重量的影响有明显联合作用（F=2.17,P=0.02）。（2）胚胎植入期暴露组,苯或甲醛对小鼠胚胎植入数目、植入胚胎总重量、胚胎均重均无明显影响;也未见对小鼠卵巢和子宫重量的影响,但脾脏和肾脏重量变化具有统计学意义（P值均小于0.05）。（3）共同暴露时苯和甲醛的联合作用:卵泡发育期,与单一甲醛暴露比较,低、中剂量的苯和高剂量甲醛联合暴露时,胚胎植入数目和每窝胚胎总重量呈现出一定的联合作用;在胚胎植入期,与单一甲醛暴露时比较,中、高剂量苯和甲醛联合暴露时,胚胎植入数目和每窝胚胎总重量呈现出一定的联合作用。2.卵巢组织细胞DNA-蛋白质交联（1）卵泡发育期暴露,苯对小鼠卵巢组织细胞DPC系数无明显影响（P=0.14）;甲醛对小鼠卵巢组织细胞DPC系数有明显影响（P=0.00）,低剂量、中剂量和高剂量与组内对照比较均有统计学意义（Z值分别为-3.93、-4.85、-4.54,P值分别为0.00,0.00,0.00）。（2）胚胎植入期暴露,苯对小鼠卵巢组织细胞DPC系数无明显影响（P=0.721）;各剂量甲醛对小鼠DPC系数影响也无统计学意义（P=0.127）。（3）卵泡发育期暴露于苯和甲醛,对卵巢组织细胞DPC系数影响存在联合作用（F=39.87,P=0.00*）。3.胚胎植入障碍与卵巢组织细胞损伤之间的关联性Pearson相关分析结果显示,卵泡发育期暴露于甲醛,卵巢组织细胞DPC系数与卵巢重量之间存在明显的负相关关系（r=-0.514,P=0.000）;与胚胎植入数目之间也存在一定程度的负相关关系（r=-0.236,P=0.060）。结论1.卵泡发育期暴露于甲醛导致胚胎植入数目减少、植入胚胎总重量减轻;表明在小鼠卵泡发育期甲醛暴露可导致明显的胚胎毒性;2.卵泡发育期或胚胎植入期暴露于苯对小鼠胚胎植入数目、植入胚胎总重量、胚胎均重等的毒性作用较小;3.卵泡发育期或胚胎植入期暴露于苯和甲醛其胚胎毒性均存在一定程度的联合作用;4.卵泡发育期甲醛暴露,卵巢组织细胞DNA损伤程度高于胚胎植入期,且卵泡发育期苯和甲醛联合暴露对卵巢损伤具有明显联合作用;5.胚胎植入障碍与卵巢组织细胞DPC系数之间呈现负相关关系,提示卵巢损伤可能是甲醛暴露导致胚胎植入障碍的重要原因之一。