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随着我国老年人口的增加,患有骨质疏松症的人口数也在逐步增加,研究治疗骨质疏松的药物至关重要,也得到了人们的高度重视。参灵健骨胶囊是我们课题组拥有专利的一种治疗骨质疏松的中药组合物,具有滋补肝肾,活血止痛之功效。本实验通过维甲酸致大鼠骨质疏松模型,对参灵健骨胶囊进行药效学评价,并从代谢水平揭示其作用机制,为开发新药提供理论依据。第一部分参灵健骨胶囊对维甲酸致骨质疏松大鼠的药效学研究目的:用维甲酸灌胃大鼠建立骨质疏松模型,从骨密度、生化检测以及病理组织观察三方面评价参灵健骨胶囊对骨质疏松大鼠的药效作用。方法:1动物和分组:健康SD大鼠60只,♂,280-300g。按体重随机分为6组:正常对照组、模型对照组、参灵健骨胶囊低剂量组、参灵健骨胶囊中剂量组、参灵健骨胶囊高剂量组和阳性对照组。正常对照组灌胃羧甲基纤维素钠,模型对照组灌胃维甲酸,各给药组及阳性组上午灌胃维甲酸,下午给相应受试物,连续四周。2检测指标2.1骨密度:用异氟烷气体麻醉大鼠,分别于实验0天、7天、14天、21天、28天用小动物成像仪五次测定大鼠股骨中段骨密度值。2.2生化检测:实验前各组大鼠禁食24h(自由饮水),水合氯醛麻醉,并迅速腹主动脉取血,加入到EP管中,离心(3500r/min,10min),分离血清,测定大鼠血清中Ca、P、ALP含量。2.3病理组织检查:实验四周后处死大鼠,完整取出各组大鼠右侧胫骨,浸泡于福尔马林溶液中固定,骨脱钙,然后HE染色,切片观察。结果:1骨密度结果:组间比较,统计实验开始前第0天测定的各组大鼠骨密度值,数据之间无统计学差异(P>0.1),符合随机分配原则。第7天骨密度值亦无统计学差异(p>0.1),说明药物初始作用不明显。统计第14天骨密度值,和正常组比较,模型组和各给药组均下降(p<0.05);和模型组相比,低剂量组、高剂量组和阳性组显著升高(p<0.05),中剂量组骨密度亦升高,但无统计学差异(p>0.1)。统计第21天骨密度值,正常组、模型组和各给药组无统计学差异(0.05<p<0.1)。统计第28天骨密度值,和正常组比较,模型组骨密度值显著降低(p<0.01),低剂量组、高剂量组和阳性组无统计学差别(p>0.1),中剂量组下降(0.01<p<0.05);和模型组比较,高剂量组和阳性组有显著升高(p<0.01),低剂量组和中剂量组也有升高(p<0.05)。各组自身比较,骨密度值呈动态性变化。正常组大鼠骨密度基本不变,但略有降低,符合老年大鼠的自然生长规律,统计数据无差别(p>0.1)。模型组大鼠骨密度持续降低,统计结果显示,灌胃维甲酸第14天开始和第0天比有显著性差异(p<0.01)。给药组大鼠骨密度先呈现一定的下降趋势,给药后又有一定的回升:低剂量组、高剂量组和阳性组第7、14、21、28天骨密度值和第0天比均无统计学差异(p>0.1);中剂量组大鼠骨密度变化较明显,第14天和第0天比较骨密度值显著降低(p<0.01),第21、28天下降减小(p<0.05)。2血液生化检测结果血钙:维甲酸灌胃大鼠后,血清中钙离子浓度变化明显,模型组相对正常组明显降低(p<0.01)。给药后,钙离子浓度有所回升,但与正常对照组相比有差异(p<0.05);与模型组比较回升较明显,健骨低剂量组和阳性组有差异(p<0.05),健骨中剂量组和健骨高剂量组有显著性差异(p<0.01)。血磷:实验大鼠血清磷含量变化显著,模型组相对正常组明显降低(p<0.01);给药后,各给药组血清磷含量升高,与正常对照组相比,健骨低剂量组、中剂量组和阳性组无差异(p>0.05),健骨高剂量组升高不明显(p<0.05);与模型组比较,健骨高剂量组和阳性组有提高,但无统计学差异(p>0.05),健骨中剂量组明显提高(p<0.05),健骨低剂量组有显著性提高(p<0.01)。碱性磷酸酶:与正常对照组相比,模型组明显升高(p<0.01);健骨中剂量组、高剂量组和阳性组无统计学差异(p>0.05),健骨低剂量组有轻微升高(p<0.05);与模型组相比,各给药组alp含量均下降,健骨低剂量组有统计学差异(p<0.05),健骨中剂量组、高剂量组和阳性组均有显著性差异(p<0.01)。血钙、血磷、碱性磷酸酶检测结果均表明维甲酸致大鼠骨吸收大于骨形成,给药后各指标有向正常对照组回归的趋势。3病理组织观察结果病理组织结果显示正常对照组大鼠胫骨骨髓细胞密集分布、无空旷区域,腔大小正常,骨皮质致密、边缘整齐;模型组骨髓腔扩大,有正常区域存在,骨质空洞严重,说明骨质疏松造模成功;给药组骨质空洞相对较小,且有类似成骨组织形成,骨髓腔和骨皮质界限模糊,可能是药物作用的结果。结论:参灵健骨胶囊能使骨密度升高,调节血钙、血磷及碱性磷酸酶含量,使之趋于正常水平,使骨髓细胞密集分布、骨质空洞减小,具有一定的抗骨质疏松作用。第二部分参灵健骨胶囊抗骨质疏松的代谢组学机制研究目的:基于代谢组学,利用液质联用技术,对维甲酸诱导的骨质疏松大鼠的代谢特征开展研究,寻找差异性代谢产物,揭示参灵健骨胶囊抗骨质疏松的作用机制。方法:1动物和分组:同第一部分。2样品采集:血浆样品:实验前各组大鼠禁食24h(自由饮水),水合氯醛麻醉,并迅速腹主动脉取血,血液加入到有肝素的ep管中,离心(3500r/min,10min),分离血浆,置-80℃冻存,备用。组织样品:大鼠取血完毕,取睾丸、附睾分别于冻存管中,液氮速冻,转移置-80℃冻存,备用。3样品预处理:血浆:4℃复溶,血与乙腈(1:3)涡旋沉淀蛋白,14000r/min,10min,低温4℃离心,取上清加水稀释,涡旋得样品。组织:分别称适量睾丸、附睾组织,加萃取液乙腈和甲醇(3:1),匀浆,混合,13000r/min,10min,低温4℃离心,上清液通过0.22μm滤膜过滤,得待测样品。4色谱质谱条件:利用AB SCIEX TripleTOFTM 5600 System采集数据。5数据处理通过样本的正、负离子检测模式的Q-Triple 5600 MS测定得原始数据,利用AB公司的markerview1.2.1代谢组学分析软件对其进行峰识别、峰过滤、峰对齐,最终获得包括质荷比(M/Z)和保留时间(Retention time)及其峰面积的二维数据阵。将上述获得的二维数据阵导入软件SIMCA-P进行了多变量统计分析。6差异代谢物的鉴别利用传统的质谱分析规律,确定代谢物的准分子离子峰并通过人类代谢组学数据库HMDL查找可能的代谢物。结果:通过对血浆及组织代谢组学数据的处理和分析,血浆中鉴定8个差异性代谢产物,分别为苯丙氨酸、色氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异己酸、甲羟戊酸、磷酸肌酸、2-甲基雌酮。睾丸中鉴定差9个异性代谢物,分别为组氨酸、高半胱氨酸、高胱氨酸、2-磷酸甘油酸、甲羟戊酸、嘌呤、核糖醇、去氧皮质酮和葡萄糖。附睾中鉴定8个差异性代谢物,分别为亮氨酸、组氨酸、高胱氨酸、苯乙酰甘氨酸、丙氨酰赖氨酸、嘌呤、3-羟基丁酸、4-甲氧基肉桂酸。结论:维甲酸致大鼠骨质疏松可能与体内氨基酸代谢、能量代谢、糖代谢、脂肪代谢及激素水平等有关,参灵健骨胶囊通过多个通道调节体内代谢来达到抗骨质疏松的作用。