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【目的】
1．采用一种全新的思路对hTNF-α(人肿瘤坏死因子α)进行重组改造，探索重组hTNF-α原核细胞克隆及表达载体的构建方法，以便能同时解决hTNF-α毒副作用和肿瘤靶向性问题。
2．探索重组hTNF-α融合蛋白在大肠杆菌λDE3中的表达及融合蛋白提取和纯化的具体方案。
【方法】
1．重组pMD18-MMP1-hTNF和 pMD18-MMP8-hTNF 质粒的构建
将转化入hTNF-α-pGBT9重组质粒的DH5 α菌液划线培养，然后挑取白色单菌落用LB液体培养基培养，将菌液送上海生工测序部测序。挑选出测序正确的菌液进行培养并提取质粒，以此质粒作为模板，用Prime 5.0 设计的引物进行PCR。将PCR得到的产物进行AT克隆，然后转化并提取重组 pMD18-MMP1-hTNF 和 pMD18-MMP8-hTNF质粒。
2．重组pGEM-collagen-MMP1-hTNF和pGEM-collagen-MMP8-hTNF原核克隆质粒的构建
将提取的重组pMD18-MMP1-hTNF和pMD18-MMP8-hTNF质粒分别用限制性内切酶SacI和EcoR I进行酶切，切下来的目的片段与同样被这两种内切酶酶切过的pGEM-collagen重组质粒用T4 DNA Ligase连接，连接产物转化入DH5α(蓝白筛选)，挑取白色阳性单菌落用LB液体培养基进行培养，取适量菌液送上海生工测序部测序。
3．重组pET-32a(+)-collagen-MMP1-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF表达质粒的构建
挑选测序正确的菌液培养并且提取 pGEM-collagen-MMP1-hTNF 和pGEM-collagen-MMP8-hTNF 重组质粒，分别用限制性内切酶 SacI和NcoI进行酶切，然后将酶切后得到的目的片段与同样被Sac I和Nco I酶切过的空载pET-32a(+)Vector通过T4 DNA Ligase的作用进行连接。将连接产物转化入DH5α(蓝白筛选)，挑取白色阳性单菌落用LB液体培养基进行培养，取适量菌液送上海生工测序部测序。然后选择测序正确的菌液培养并提取 pET-32a(+)-collagen-MMP1-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF 重组质粒，转化入λDE3中(蓝白筛选)，挑取白色阳性单菌落用LB液体培养基进行培养，取适量菌液送上海生工测序部测序。
4．融合蛋白的表达、提取与纯化
用IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导融合蛋白的表达，按Novagen公司BugBusterHis·Bind Purification Kits 试剂盒方法进行融合蛋白的提取和纯化。用SDS-PAGE电泳初步鉴定融合蛋白是否表达以及融合蛋白的大小。
【结果】
1．构建了带有胶原酶(MMP-1和MMP-8)底物序列和hTNF-α突变体基因的2种克隆质粒(重组pMD18-MMP1-hTNF和pMD18-MMP8-hTNF质粒)。
2．构建了带有胶原蛋白序列和胶原酶(MMP-1和MMP-8)底物序列的rhTNF-α的2种克隆质粒(重组pGEM-collagen-MMP1-hTNF和pGEM-collagen- MMP8-rhTNF质粒)。
3．构建了带有胶原蛋白序列和胶原酶(MMP-1和MMP-8)底物序列的rhTNF-α的2种原核表达质粒(重组pET-32a(+)-collagen-MMP1-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF质粒)。
4．初步确立了重组 pET-32a(+)-collagen-MMP1-hTNF和pET-32a(+)-collagen-MMP8- hTNF质粒在大肠杆菌入DE3中的表达条件，获得两种rhTNF-α融合基因的表达产物。
5．初步确立了重组 pET-32a(+)-collagen-MMP1-hTNF 和 pET-32a(+)-collagen-MMP8-hTNF融合基因表达产物的纯化方案，获得两种rhTNF-α融合蛋白的初步纯化产物。
6．由于时间的限制未能进一步进行表达条件和纯化条件的优化，获得大量高纯度的有活性的目的蛋白。因此，尚无法确定所得到的蛋白是否有抗肿瘤活性及其靶向性的优劣。
【结论】
本课题应用一种全新思路成功构建了两种原核克隆载体和两种原核表达载体，在大肠杆菌中表达成功，并进行了初步纯化，表明此全新重组思路具有可行性。但是本实验尚未获得大量高纯度的rhTNF-α融合蛋白，同时融合蛋白的表达和纯化方案也需要进一步改进和完善。