微小RNA(micro-RNA,miRNA)是一类长约22nt的非编码功能小RNA,它在许多生物中都有表达。miRNA原初转录本(pri-miRNA)经过核内和胞质中一系列的加工修饰后形成成熟的miRNA。首先,miRNA基因在RNA polymeraseⅡ作用下,转录生成pri-miRNA;然后在内切酶Drosha作用下,pri-miRNA释放出60—70nt的前体(pre-miRNA),后者具有不完美的发卡结构;最后,pre-miRNA在exportin5作用下进入胞质,经DICER切割形成成熟miRNA。成熟的miRNA通过与靶基因3’非翻译区(3’UTR区)形成不完全配对,从而抑制靶基因翻译,或形成接近完全的配对,导致靶mRNA降解。最近发现在人类基因组中,大约有533个miRNA基因座位,数目大约为蛋白编码基因的1%,但可以调控大约30%的人类基因,说明miRNA是一个调控网络。miRNA在很多生物的生理和病理过程中发挥重要作用,影响细胞发育、凋亡和增殖,并与疾病发生相关。越来越多的证据表明,许多肿瘤的发生与发展与miRNA的异常表达相关,例如乳腺癌、脑癌、慢性粒细胞白血病、结肠癌、肝癌和肺癌等。本论文以乳腺癌表达异常的miRNA为研究对象,开展了下述的系列研究。第一部分研究显示,某些在肿瘤组织中低表达的miRNA能够抑制癌基因或细胞生长相关的基因,因此具有抑癌基因的活性,例如let-7家族。为了寻找具有抑癌活性的miRNA,根据过去对乳腺癌表达谱的报道和一些开放数据库,本研究挑选了10个在乳腺癌中低表达的miRNA,它们依次是:mir-30d、mir-99a、mir-100、mir-125b1、mir-130a、mir-126/126*、mir-145、mir-191、mir-199a和mir-214。我们构建了上述10个候选miRNA的表达载体,通过在细胞中对它们进行过量表达,检测它们对细胞的影响。结果发现,mir-126可以显著抑制细胞的增殖。进一步实验表明,mir-126可以抑制细胞从G0/G1期进入S期。通过生物信息软件预测,结合体外靶基因3’UTR luciferase报告基因验证,我们发现mir-126可以调控IRS-1的表达。Western blot和real-time PCR实验表明,mir-126并不影响IRS-1mRNA水平,而是通过影响翻译导致IRS-1蛋白表达量下降,结果抑制了HEK293和乳腺癌细胞MCF-7的增殖。定量分析显示,在HEK293、HUVEC和MDA-MB-231中,IRS-1和mir-126的表达呈负相关。该部分研究确定了mir-126能够抑制细胞从G/G0进入S期,IRS-1是其靶基因。结合其它学者的研究成果,我们推测mir-126可能通过作用于IGF1R-PI3K/Akt信号通路,产生抑制细胞增殖的效应。第二部分成熟miRNA分子量较小,所以检测比较困难。目前用于检测miRNA的方法主要有以下三种:1)基于分子杂交的Northern Blot。该方法需要较多的总RNA,且经常要使用同位素,操作繁琐,不适用于大通量检测。2)基于Stem-loop RT-PCR的检测方法。这种方法要求每个miRNA都需要特异的反转录,操作更为繁琐,对样本和试剂的耗费较多,特异性也比较低。为了提高特异性,有些试剂盒使用Taqman探针进行检测,价格随之大幅提升。所以这个方法也不适用于大样本、多个miRNA的检测;3)microarray芯片检测。目前很多公司都推出相关产品,但花费高,操作也不够灵活机动。经过多次摸索,我们建立了polyA RT-PCR检测miRNA的方法。该方法操作简单,适用于中等规模的检测,有望在临床中获得应用。使用polyA RT-PCR,我们检测了侵袭能力不同的乳腺癌细胞中22种miRNA的表达情况,结果显示mir-29a/c、mir-99a、mir-100和mir-125b1在高侵袭性乳腺癌细胞中高表达,而mir-191则低表达。这些结果最终经real-time RT-PCR得到了确认。更多乳腺癌细胞中的检测结果显示,mir-29a/c、mir-99a、mir-100和mir-125b1同样在高侵袭性细胞中高表达,但mir-191被排除。同时,我们又引入taqman通用探针对其精确的定量,得到了同样的结果,通用taqman探针的引入也使得polyA RT-PCR检测方法更为精确。为了探索这些miRNA与乳腺癌之间的关系,我们使用了miRNA inhibitor对miRNA进行功能封闭,实验结果显示,mir-125b封闭剂会明显抑制细胞增殖并降低高侵袭乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT-549穿透martrigel的能力。另外,在低侵袭性乳腺痛细胞MCF7中种构建了mir-99a、mir-100和mir-125b1的稳定表达细胞株,这为我们下一步进行动物体内试验做好了准备。这些只是初步的实验结果,我们还将通过一系列实验检测这些miRNA对乳腺癌细胞的影响。它们对肿瘤侵袭转移,以及成瘤能力的影响最终还要在动物实验中进一步确认。第三部分HOXA10是抑癌基因,它可以诱导P53表达,还能抑制癌基因SNAIL的表达。NOXA10在高侵袭乳腺癌中常因甲基化而低表达甚至不表达。但临床试验表明,HOXA10在高恶性乳腺组织中mRNA的表达量并不一定降低。我们的实验结果也表明,高侵袭乳腺癌细胞BT549的HOXA10mRNA表达水平较高。我们推测,HOXA10可能存在mRNA水平上的调控。通过生物信息学分析,结合3’UTR luciferase报告基因检测方法,我们发现mir-135a可以显著下调HOXA10的表达。采用定点突变的方法,我们确定了mir-135a在HOXA10 3’-UTR区的作用位点。PCR检测显示,在高侵袭乳腺癌细胞中,mir-135a和HOXA10 mRNA有共分布现象。miRNA inhibitor结果显示,mir-135a的封闭可以导致BT-549细胞侵袭能力的下降。我们将进一步确认mir-135a在乳腺癌侵袭中的地位,并验证mir-135a对HOXA10的调控作用。