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研究目的和背景胰岛β细胞功能缺陷和外周组织胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的二个主要环节,近来研究表明,前者在其中起着更为重要的作用。葡萄糖是胰岛β细胞功能最为重要的调节物,在高糖状态下,机体通过胰岛功能增强,胰岛β细胞肥大、增殖,胰岛素合成与分泌增多,可使血糖回复至正常水平。因此,探讨β细胞在高糖状况下功能代偿性增强的机制,对于2型糖尿病的防治有重要意义。本课题组在前期研究中发现,在离体和在体状态下高糖均能显著上调大鼠胰岛色氨酸羟化酶(Tph1)的表达,同时伴有血清素合成增加,其调节作用呈浓度与时间依赖性,在离体大鼠胰岛中过表达Tph1能显著增强其胰岛素分泌功能。本研究通过高糖灌注大鼠模型加Tph1抑制剂处理、构建胰岛β细胞特异性Tph1过表达大鼠进一步在体观察Tph1在葡萄糖增强胰岛功能中的作用。另外,我们的基因芯片结果发现,高糖显著降低热休克蛋白90(Hsp90)的表达,通过对其进一步研究探索胰岛β细胞在高糖状态下的功能代偿机制。材料与方法1.SD大鼠分别连续腹腔注射Tph1抑制剂(PCPA)或者0.45%生理盐水2d,于大鼠颈静脉处分别给予50%葡萄糖或0.45%生理盐水灌注24h,检测血糖以及胰岛素水平,Western印迹法、实时荧光定量PCR以及免疫组化检测大鼠胰岛Tph1mRNA、蛋白表达以及血清素水平;2.构建胰岛β细胞特异性Tph1过表达大鼠,对4周龄的转基因大鼠进行分笼及基因型鉴定,繁殖建立稳定的遗传背景;3.对10周龄的转基因大鼠和野生型大鼠进行代谢监测,包括体重、进食量、随机血糖,进行腹腔注射糖耐量试验(IPGTT)和胰岛素耐量试验(ITT),采血测血糖,并以ELISA检测胰岛素水平;4.采用胶原酶灌注法分离转基因和野生型大鼠的胰岛,用3.3和16.7mmol/L的葡萄糖刺激1h,以ELISA检测胰岛素的分泌水平;5.抽提不同组织的蛋白,Western印迹法检测Tph1蛋白表达;6.不同浓度葡萄糖预处理分离的大鼠胰岛后,采用实时荧光定量PCR、Western印迹法检测Hsp90 mRNA和蛋白的表达变化;7.不同信号通路的激动剂和抑制剂分别处理大鼠胰岛,检测Hsp90mRNA表达变化;8.以Hsp90抑制剂(17-DMAG和CCT018059)处理大鼠胰岛,ELISA检测胰岛素分泌,实时定量PCR检测胰岛功能相关基因的表达水平;9.免疫组化技术观察Tph1、胰岛素、血清素、Hsp90在大鼠胰岛中的表达。结果1.高糖环境在体状态下Tph1抑制剂PCPA明显抑制高糖灌注刺激的血清素合成和胰岛素的分泌,进一步升高血糖;2.构建的转基因大鼠在胰岛特异性高表达Tph1;3.与野生型大鼠相比,Tph1过表达转基因大鼠的体重、进食量、空腹血糖、基础胰岛素分泌没有明显差别,但餐后血糖下降,同时伴随着餐后胰岛素分泌显著升高;4.IPGTT结果显示,Tph1过表达转基因大鼠的糖耐量明显增强,葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)增加,ITT结果显示两组大鼠的胰岛素敏感性相似;5.Tph1过表达转基因大鼠胰岛的血清素合成增加;6.与野生型大鼠胰岛相比,分离的Tph1过表达转基因大鼠胰岛对葡萄糖刺激的反应性明显增强;7.大鼠胰腺切片免疫荧光染色显示Hsp90在胰岛β细胞中高表达;基因芯片结果显示高糖抑制大鼠胰岛Hsp90 mRNA的表达,实时定量PCR和Western印迹进一步证实芯片结果。以不同浓度葡萄糖预处理大鼠胰岛,实时定量PCR结果显示5.6mmol/L葡萄糖部分下调Hsp90表达,而超过8.3mmol/L浓度时葡萄糖对Hsp90没有进一步抑制作用;8.葡萄糖激酶(GK)激动剂可抑制Hsp90的表达,而钙离子通道调控剂、非代谢葡萄糖类似物对Hsp90的表达没有作用;9.Hsp90抑制剂处理大鼠胰岛后GSIS增加,同时胰岛功能相关基因表达发生改变。结论1.Tph1活性抑制可降低高糖灌注诱导的胰岛功能增强;2.胰岛β细胞特异性Tph1过表达转基因大鼠通过Tph1促进血清素的合成进而增强胰岛β细胞的分泌功能,改善糖耐量,而不影响胰岛素敏感性;3.高浓度葡萄糖可能通过GK的激活显著降低胰岛β细胞Hsp90的表达;4.抑制Hsp90可通过改变胰岛功能相关基因的表达增强GSIS。