研究背景：周围神经损伤是一种发生率较高的致残因素,周围神经损伤后,在一定程度上能进行修复再生,神经再生是周围神经损伤后的修复过程出现的一个重要标志。神经损伤后机体修复的第一步则是神经元胞体的增大、尼氏小体的分解、细胞核移至细胞周边,启动蛋白合成。由于损伤远端神经因为营养障碍甚至中断,细胞质凝结、液化,轴突脱髓鞘崩解,周围神经出现特征性的Wallerian变性,主要表现为损伤部位远段髓鞘崩解和吞噬以及轴突的枯萎,以及损伤部位近段不同程度的相似改变。这种Wallerian变性不是在神经损伤后马上出现的,当Wallerian变性过程一旦激活,轴突就能在几小时之内完全崩解,接着,损伤部位局部的雪旺细胞和募集的巨噬细胞将吞噬轴突和髓鞘碎片。髓鞘碎片的清除对于神经的修复十分重要,因为髓鞘含有轴突生长的抑制因子,很有可能妨碍神经再生。之后,残留的基底膜和其关联的雪旺细胞(Schwann cells, SC)形成完整的内膜管道结构,围成一个能供神经轴突再生的通道。神经轴突一旦开始再生,远端的神经残端就形成新芽重新进入神经内膜管,然后朝着靶组织生长,其轴突仍能精准地向之前关联的组织定位并重新建立功能性的突触。周围神经再生过程涉及雪旺细胞的退变、增殖和迁移；巨噬细胞向损伤区的定向趋化,对变性雪旺细胞和崩解髓鞘的吞噬；轴浆的运输和轴突的再生等方面的变化,其间有多种细胞因子参与作用。其中巨噬细胞对周围神经再生的影响可从两个方面考虑：(1)巨噬细胞的清扫作用；(2)巨噬细胞分泌活性物质通过雪旺细胞间接影响神经再生。神经生长因子(NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一,也是最早发现和最典型的神经营养因子,对神经元的发育、分化和维持正常功能具有极重要的作用。大量的实验研究表明,当神经细胞受损后,NGF不仅可以保护其效应神经元,减少其变性死亡,还可以促进再生神经纤维的生长,有利于神经功能的恢复。神经组织中NGF蛋白增高不但可以引导神经的再生,而且随着轴突的生长,生长锥的不断前移,其表面受体与NGF相结合,通过胞饮作用被摄入,经逆行轴浆转运输送到神经元的胞体,支持神经元的生长,促进神经的再生。因此神经受损后NGF表达的增加,将有利于受损神经元修复,促进其再生。生理条件下,NGF主要由神经支配的靶器官(如肌肉、腺体等)和神经胶质细胞(外周神经为雪旺细胞)所产生。外周神经损伤时,局部增殖的雪旺细胞则成为NGF合成与分泌的主要来源。损伤局部所产生的NGF经轴突逆行运输至神经细胞,促进神经元存活和神经突起延伸,加速神经修复与再生。因此雪旺细胞合成与分泌NGF能力的强弱是影响外周神经再生质量好坏的重要因素之一。细胞外基质(ECM)是指沉积于细胞间的大分子物质,主要存在于包绕轴突的雪旺细胞外的基膜内,其主要成分由雪旺细胞产生,包括层粘连蛋白(Laminin)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)、胶原和硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)等,ECM成份能为神经生长提供适当的“黏着性”,使轴突沿着基质桥生长,保持生长锥的稳定性,引导神经纤维定向生长。其中Laminin对神经再生的作用已经得到公认,Laminin主要存在于基膜管内侧,可自我聚集,也可结合基质内其它生物大分子,亦可和细胞通过整合素、低聚糖及其它受体结合,从而决定细胞的分化、迁移和结构,保持组织的表型,促进其存活。在胚胎和新生期,Laminin在周围神经内膜管的内表面有较多表达,它靠其浓度梯度引导神经细胞和神经纤维生长的方向,成年期表达较少。坐骨神经损伤后,Laminin的表达重新开始增多可能与雪旺细胞的增殖并大量分泌Laminin,从而使其发挥神经导向和神经营养因子的作用有关。RSC9细胞株是大鼠雪旺细胞经过原代细胞培养自然转化而成,是一种较理想的类Schwann细胞,本实验旨在以往的研究基础上以RSC96细胞为模型来探讨巨噬细胞对RSC96细胞表达NGF、Laminin的作用,初步探索模拟神经轴突形态的拓扑结构对RSC96细胞表达NGF及Laminin的影响。目的：1.对比原代培养的雪旺细胞与细胞株RSC96细胞,检测NGF及Laminin表达的差异。2.研究不同活化状态的巨噬细胞对RSC96细胞表达NGF及Laminin的影响。3.初步探索模拟神经轴突形态的拓扑结构对RSC96细胞表达NGF及Laminin的影响。方法1.取3～5天龄SD乳鼠的双侧的坐骨、臂丛神经,D-Hank’s液冲洗2次,解剖显微镜下仔细剥除神经外膜,D-Hanks液反复冲洗2次,剪碎至1mm3大小的组织块,双酶消化法进行分离培养,阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长,胰酶快速消化传代进一步纯化,光镜下进行形态学观察。常规复苏培养RSC96细胞。隔天换液,待细胞融合率为80%时用胰蛋白酶消化传代,光镜进行形态学观察。胰蛋白酶消化收集两种细胞,提取总蛋白,Western blotting检测NGF和Laminin蛋白的表达水平。2.取两只1月龄SD幼鼠,一只注射DMEM/F12培养液到腹腔,按摩10分钟后抽取腹腔液体培养获得巨噬细胞,一只坐骨神经远端切断,预溃变2d后,制成神经匀浆液,回注自体腹腔3d后,抽取腹腔液体培养获得巨噬细胞即为自体神经匀浆激活的巨噬细胞。3.利用Transwell建立大鼠腹膜腔巨噬细胞和RSC96细胞的共培养体系,分5组：以单纯未激活态巨噬细胞、激活态巨噬细胞及不用巨噬细胞共培养的RSC96细胞作为A、B、C对照组,未激活态巨噬细胞与RSC96细胞共培养组及激活态巨噬细胞与RSC96细胞共培养组为D、E实验组。4.于细胞培养第3天收集A、B对照组巨噬细胞；其他组RSC96细胞,用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(dT)逆转录酶得到cDNA。经特定引物PCR扩增,取相同量的逆转录产物进行qPCR反应；qPCR反应采用SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix(2X),按照说明书在冰上配制PCR反应液,每个样品重复3次。反应结束后确认PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,采用2-ΔΔCT法确定特定荧光域值对应循环数的Ct值,对目标基因定量。5.于细胞培养第3天收集各组细胞培养液,利用Rat Laminin ELISA试剂盒及Rat p-NGF ELISA试剂盒进行测定,按产品说明书步骤进行操作,收集各组培养基上清,加入预先包被有NGF或Laminin多克隆抗体的96孔板内,4℃孵育24h。洗去多余抗体,加入生物素标记的兔抗鼠IgG室温孵育2h。最后加入终止液,37℃孵育25min。在酶联免疫检测仪(Bio-Rad680)OD450nm处测量各孔的吸光值,系统精密度为最小1.0ng/ml。每组样品重复实验2次。6.于细胞培养第3天收集A、B对照组巨噬细胞；其他组RSC96细胞,按照细胞总蛋白分离试剂盒说明书进行分离提取。用Bradford Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白含量。取等量样品总蛋白与等体积2×SDS凝胶上样缓冲液混匀,100-C加热煮沸10min,经SDS-PAGE凝胶电泳分离。用湿电转移法将蛋白转移至PVDF膜上,分别采用抗NGF,抗Laminin和抗β-actin一抗孵育2h,三次洗膜后,加入HRP-偶联二抗,进行免疫反应,化学发光法检测条带。条带信号强度应用Image J图像分析软件进行分析。7.RSC96细胞常规复苏后24h换液,2-3d传代扩增,扩增培养24小时后接种于表面拓扑结构上,并进行分组,对照组A：六孔板空白孔内直接接种培养RSC96细胞。实验组B：随机排列的静电纺丝上接种培养RSC96细胞。实验组C：平行排列的静电纺丝上接种培养RSC96细胞。各组接种细胞数量相同。各组细胞于37℃含5%CO2的培养箱中培养3天(期间换液1次),提取各组细胞的蛋白和RNA按照上述步骤qPCR检测基因的表达,Western blot分析蛋白含量。结果1.光镜下观察,雪旺细胞胞体呈双极纺锤形,周缘有亮带,胞核呈卵圆形或长圆形,细胞两极有长短不等的突起,细胞间常有端对端、肩并肩排列,排列呈放射状或巢状；RSC96细胞呈现典型的双极纺锤形或多角形,绝大多数细胞伸出长突起,其生长形态与原代雪旺细胞非常相似；Western blotting结果发现体外培养的RSC96细胞也可表达NGF及Laminin蛋白,与原代雪旺细胞相似。2.共培养后RSC96细胞形态变化不大,数量上可看到增多；未激活态巨噬细胞呈圆形,无突起,体积基本等大；激活态巨噬细胞可见胞体内吞噬的神经碎片,形状体积不规则。3.qPCR检测基因的表达：A、B两组对照组的细胞均无NGF和Laminin基因的扩增表达。剩余3组RSC96细胞NGF基因的表达差异均有统计学意义(P<0.05),E组NGF表达高于同一时间其他组,差异均有统计学意义(P<0.05),D组高于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。对于3组RSC96细胞Laminin基因的表达,D组和C、E两组的差异有统计学意义(P<0.05),但C组和E组差距无统计学意义(P>0.05)。4.ELISA测定培养液中NGF与Laminin的含量：A、B两组对照组的细胞培养液中NGF及Laminin的含量很少,相对其他组可忽略。剩余3组的细胞培养液中NGF含量相对浓度差异均有统计学意义(P<0.05),E组培养液NGF含量高于同一时间其他组,差异均有统计学意义(P<0.05),D组高于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组细胞培养液中Laminin含量相对浓度差异均无统计学意义(P>0.05),不能说明其有差异。5.Western blot分析蛋白含量：A、B两组对照组的细胞蛋白条带显示均无NGF和Laminin的表达。剩余3组RSC96细胞蛋白的NGF的表达差异均有统计学意义(P<0.05),E组NGF表达高于同一时间其他组,差异均有统计学意义(P<0.05),D组高于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组细胞蛋白中Laminin含量灰度值差异均无统计学意义(P>0.05),不能说明其有差异。6.静电纺丝上培养RSC96细胞NGF和Laminin基因的表达及蛋白含量：3组细胞培养3天,B、C两组实验组的RSC96细胞NGF基因的扩增表达量很少,相比A对照组有很明显的差异,差异有统计学意义(P<0.05),B组和C组之间没有明显差异；3组细胞均有Laminin基因扩增表达,且呈递增趋势,各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。各组细胞蛋白条带显示均有NGF和Laminin的表达,其中各组NGF蛋白的表达无明显差异,且无统计学意义(P>0.05)；各组Laminin蛋白的表达呈递增趋势,各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.发现体外培养的RSC96细胞生长形态与原代雪旺细胞非常相似；也可表达神经营养因子及层粘连蛋白,是一种较理想的原代雪旺细胞替代品,避免了长周期且繁杂的原代雪旺细胞培养及雪旺细胞纯度不高和长期培养雪旺细胞功能不佳等不足。2.巨噬细胞(化学因素)对RSC96细胞NGF表达有促进作用,受其活化状态的影响,激活状态的巨噬细胞的促进作用更明显；对影响RSC96细胞Laminin的表达作用不明显,无统计学意义,考虑laminin等基底膜成分是雪旺细胞与再生轴突接触并开始形成髓鞘和基底膜时才大量分泌的。3.通过模拟轴突形态的表面拓扑结构(物理因素)来影响RSC96细胞,检测RSC96细胞NGF及Laminin的表达差异,发现其促进了Laminin的表达,并且平行排列结构促进作用最明显。