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目的：严重烧伤后骨骼肌蛋白代谢以高分解代谢和负氮平衡为特点,我所以往研究发现泛素蛋白酶体途径是骨骼肌蛋白分解的主要机制,其中肌肉萎缩盒F蛋白(MAFbx)和肌肉特异性环指蛋白1(MuRF1)是骨骼肌蛋白分解的关键酶,胰岛素能够抑制骨骼肌蛋白分解。但目前对于烧伤后骨骼肌MAFbx和MuRF1表达变化及其调节机制的研究尚不完善。已知泛素蛋白酶体参与的蛋白分解过程需要ATP提供能量,骨骼肌的能量状态可能影响着蛋白分解代谢。单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)是调节三磷酸腺苷(ATP)生成的关键分子,近年来又发现AMPK的活化抑制蛋白合成,然而,迄今为止对于骨骼肌能量状态及AMPK对骨骼肌蛋白分解代谢影响和机制的报道甚少。为进一步阐明烧伤后骨骼肌蛋白分解代谢的机制,指导临床治疗,本课题试图通过动物实验和细胞培养实验探讨：(1)烫伤大鼠骨骼肌蛋白分解、能荷和AMPK的变化；(2)烫伤大鼠血清对L6肌管蛋白分解、能荷和AMPK的影响；(3)L6肌管AMPK对蛋白分解的调节作用,及其与胰岛素信号通路相互作用的机制。方法：1.动物实验：雄性Wistar大鼠100只(180-220g),随机分为两组：(1)对照组(n=50)；(2)烫伤组(n=50),背部置于94℃热水12s致30%总体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤。分别于伤后6h、1d、3d、5d和7d(n=10)麻醉处死大鼠,解剖分离双侧胫骨前肌、趾长伸肌(EDL)和比目鱼肌。实验过程中每日称量体重,实验结束时称量肌肉重量。Western blotting检测胫骨前肌AMPK表达和活性,实时定量PCR(Q-PCR)检测胫骨前肌AMPKα、丝氨酸／苏氨酸激酶11(LKB1)、MAFbx及MuRF1的mRNA表达水平,高效液相色谱法(HPLC)测定胫骨前肌核苷酸水平,计算AMP(单磷酸腺苷)／ATP比值和细胞能荷(EC)。2.细胞培养实验A：采用上述烫伤动物模型,雄性Wistar大鼠40只(200-250g),随机分为两组：对照组(n=20)和烫伤组(n=20),伤后12h无菌抽取大鼠腹主动脉血液,制备血清。10%胎牛血清(FBS)预处理低血清分化的L6肌管12h后,分别采用含10%假伤大鼠血清的DMEM(10%SS组)、或含10%烫伤大鼠血清的DMEM(10%BS组)孵育肌管不同时间(0、10min、1h、6h、24h)。L6肌管蛋白、mRNA和核苷酸水平的测定同方法1。3.细胞培养实验B：低血清分化的L6肌管于无血清DMEM中预处理12h后,分别于不同浓度或不同时间条件下,用含AMPK活化剂(AICAR,5-咪唑-4-酰胺-1-β-D-呋喃糖核苷)或含胰岛素的DMEM处理L6肌管,部分实验中采用PI3K抑制剂(wortmannin)、Akt抑制剂(Akt InhibitorⅣ)或AMPK抑制剂(Compound C)预处理肌管1h。Western blotting检测L6肌管AMPK、Akt、糖原合成酶激酶(GSK)3-β和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的表达及其活性,mRNA和核苷酸水平的检测同方法1。结果：1.(1)大鼠烫伤后体重较对照组下降,于伤后3d最为显著(p<0.05)。大鼠EDL重量和EDL重量／体重比值于伤后1～3d显著低于对照组(p<0.01)。(2)与对照组比较,烫伤后6h胫骨前肌MAFbx mRNA表达明显上调(p<0.01),烫伤后6h和1d,胫骨前肌MuRF1 mRNA表达明显上调(p<0.01),于5d和7d明显下降(p<0.01或p<0.05)。(3)烫伤后6h,大鼠胫骨前肌AMPKα(Thr172)磷酸化水平高于对照组(p<0.05),其后逐渐下降,于3d显著低于对照组(p<0.01),以后又升高。烫伤对胫骨前肌AMPKα蛋白表达无影响(p<0.05)。(4)烫伤后1d,AMPKα2mRNA表达明显低于对照组(p<0.01)。(5)烫伤后6h,LKB1 mRNA水平较对照组上调(p<0.01),其后下降,于3d和5d明显低于对照组(p<0.01),7d有所回升。(6)烫伤后6h、1d、5d和7d,AMP／ATP比值较对照组升高(p<0.01),而EC较对照组降低(p<0.01或p<0.05)。2.(1)烫伤大鼠血清孵育L6肌管24h显著上调MAFbx和MuRF1的mRNA表达(p<0.05)。(2)与10%SSs组比较,10%BS组L6肌管AMPKα蛋白表达显著下降(30min、1h、6h,p<0.01),而AMPKα磷酸化水平升高(1h、6h,p<0.05；24h,p<0.01)。(3)10%BS组L6肌管AMPKα1 mRNA表达于24h较10%SS组降低(p<0.01),AMPKα2 mRNA表达于1h、6h和24h均较10%SS组降低(p<0.05)。(4)10%BS组L6肌管LKB1 mRNA表达于24h较10%SS组升高(p<0.01),然而,烫伤大鼠血清对L6肌管AMP／ATP比值和EC无影响(p>0.05)。3.(1)AMPK活化剂AICAR以剂量依赖方式抑制MAFbx和MuRF1 mRNA表达,Compound C预处理可抑制AICAR对MuRF1基因表达的上调作用(p<0.01)。(2) AICAR以剂量依赖方式上调Akt (Ser473)和GSK3-β(Ser9)的磷酸化水平,与激活PI3K有关。(3)胰岛素以剂量依赖的方式下调MAFbx和MuRF1 mRNA表达,AICAR能够逆转胰岛素对MAFbx和MuRF1 mRNA表达的抑制作用(p<0.01)。(4)胰岛素以剂量依赖方式去磷酸化抑制AMPK,其机制为通过激活Akt实现。(5)胰岛素以剂量依赖方式抑制肌管LKB1 mRNA表达,而对AMP/ATP和EC无显著影响(p>0.05)。结论：烫伤大鼠骨骼肌能量状态的下降激活AMPK, AMPK的活化上调骨骼肌泛素E3连接酶的基因表达,蛋白分解增强。AMPK与蛋白代谢密切相关的胰岛素信号通路相互作用,AMPK激活Akt,而胰岛素抑制AMPK,胰岛素下调蛋白分解代谢的可能机制之一为抑制AMPK。因此,烫伤后骨骼肌AMPK的活化可促进蛋白分解代谢,针对AMPK的治疗措施可能是抑制烧伤后蛋白高分解的新靶点。