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Crustins是广泛存在于甲壳动物中的一类富含半胱氨酸、7-14kDa的阳离子抗菌肽,能够参与细菌、病毒等引起的先天性免疫应答。该家族分为五种类型,且具有典型的结构特征:N-端存在一个信号肽,C-端有一个含8个保守半胱氨酸的WAP结构域。本文利用PCR克隆技术从拟穴青蟹中克隆得到了两个I型和两个II型Crustins,在序列分析的基础上,解析了其基因结构特点,检测了其在心脏、血淋巴细胞、肝胰腺、鳃、肠、卵巢以及甲壳等正常组织/器官中的分布表达谱,以及受到LPS和PolyI:C诱导后的转录表达情况。本研究结果将进一步丰富Crustins的相关知识,同时为探讨该家族成员的生物学功能积累基础资料。主要结果如下:1、获得了两个I型Crustins基因:命名为SpCrus1a和SpCrus1b。两者的cDNA全长为746 bp和675 bp,分别编码一个113和109个氨基酸组成的多肽。序列分析显示,两者在氨基端和羧基端分别具有一个信号肽(氨基酸长度分别为20和18)和一个含8个保守半胱氨酸的WAP结构域(氨基酸长度分别为52和54),且在信号肽与WAP结构域之间存在一个半胱氨酸富集区,符合典型的I型Crustins结构特征。预测其成熟肽部分的分子量分别为10030.47 Da和10091.60 Da,理论等电点为8.30和8.49。系统进化分析显示,两者与甲壳动物I型Crustins聚为一支,且与远洋梭子蟹亲缘关系最近。基因结构分析表明,两者均为4个外显子/3个内含子结构。在正常组织/器官中的分布表达谱显示,两者有着不同的表达模式:SpCrus1a在采集的成蟹各组织/器官中呈全身性表达,且在鳃中表达量最高;而SpCrus1b则在主要在鳃中表达,在其他组织/器官中几乎不表达。活体刺激实验中,经LPS诱导后6h和24h均能引起两者的上调表达,分别上调2.82倍(P<0.05)、3.44倍(P<0.01)和5.63倍(P<0.01)、3.64倍(P<0.01);与此同时,经PolyI:C诱导后12h,也均能引起两者的表达量增加,分别上调了14.46倍(P<0.01)和3.71倍(P<0.01),且SpCrus1a的响应时间更为持久(12-24h),18h和24h时分别上调8.02倍(P<0.01)和5.79倍(P<0.05)。结果表明,SpCrus1a和SpCrus1b在一定程度上参与了拟穴青蟹的抗细菌和抗病毒免疫反应。2、获得了两个II型Crustins基因:命名为SpCrus2a和SpCrus2b。两者的cDNA全长为1373 bp和1497 bp,分别编码一个131和225个氨基酸组成的多肽。序列分析显示,两者在氨基端和羧基端分别存在一个信号肽(氨基酸长度分别为20和17)和一个含8个保守半胱氨酸的WAP结构域(氨基酸长度均为51),在信号肽与WAP结构域之间除拥有一个半胱氨酸富集区外,在靠近N-的位置上还存在一个甘氨酸富集区,符合典型的II型Crustins结构特征。预测其成熟肽部分的分子量分别为11791.14Da和20586.00Da,理论等电点为7.66和7.77。系统进化分析显示,两者与甲壳动物II型Crustins聚为一支。基因结构分析表明,两者均为2个外显子/1个内含子结构。在正常组织/器官中的分布表达谱显示,两者有着相似的表达模式:主要在鳃中表达,而在其他组织/器官中几乎不表达。活体刺激实验中,经LPS诱导后12h,能引起SpCrus2b的上调表达,上调近2.39倍(P<0.05),随着时间的推移,在诱导后24h时,SpCrus2a和SpCrus2b同时呈现上调,分别上调1.76倍(P<0.05)和2.71倍(P<0.01);经PolyI:C诱导后6h,SpCrus2a呈现显著下调,为对照组的0.27倍(P<0.01),而SpCrus2b在诱导后12h呈显著上调,上调2.31倍(P<0.01)。结果表明,SpCrus2a和SpCrus2b可能在拟穴青蟹的抗细菌与抗病毒免疫过程中扮演着重要角色。