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乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是肝细胞癌(HCC)的主要危险因素。流行病学研究也提供了大量的数据证明HBV感染与HCC有因果关联。自从PCR技术扩增病毒DNA面世后,对HBV基因组序列异质性及其在发病机制和病毒蛋白表达作用的调查研究,已经成为嗜肝病毒研究的重点。HBV基因在慢性感染或进行性肝病发展过程中进行突变选择,其中最重要的免疫逃逸突变有S区的“a”抗原决定簇突变、C区的CTL识别位点突变及前C区的终止密码突变等,而其他区域研究尚少。我国是HBV高流行区,其流行株与欧、美和日本等低流行区有区别,主要基因型为B型和C型。现存HBV标准序列多是用国外流行株全序列。建立我国HBV流行株的基因库和标准序列,是HBV变异研究的基础工作。HBV基因位点的变异与HBV相关疾病的关联分析可提示一些基因位点的变异可能与临床及乙肝相关疾病有关。目的对乙肝病毒e抗原(HBeAg)阳性无症状表面抗原(HBsAg)携带者(ASCs)B2和C2基因亚型全基因序列测定,初步建立以中国流行株序列为基础的B2、C2基因型的HBV标准序列。同时对B、C型慢性乙型肝炎(CHB),肝硬化(LC)和肝癌(HCC)患者的HBV部分基因序列测定,探讨不同基因型(主要是C基因型)及基因变异与乙肝相关肝病不同疾病状态的关联。方法利用普通及巢式聚合酶链式反应(Nest-PCR)方法,分别扩增485例HBeAg阳性B2和C2型ASCs全基因序列以及81例CHB,98例LC患者和135例乙肝阳性HCC患者的HBV部分基因序列并测序。所有的基因序列片段先用MEGA5.0 clustal w软件进行序列比对然后对每段进行拼接,将ASCs拼接成全长。以每个碱基频率最高点作为"野生型",获得B2和C2的标准序列。在所有的样本中只要每一类疾病B或C型中每个点突变频率大于10%即作为研究“热点”。数据录入与分析采用SPSS 16.0统计软件及简明统计软件10.35,应用单因素χ2检验和非条件Logistic回归模型分析基因型、变异位点及其交互作用与ASC、CHB、LC及HCC之间的关系。图像处理软件ORIGIN6.0分析不同疾病状态的不同年龄段的HBV突变频率变化。结果1.获得了HBeAg阳性的ASCs的乙肝病毒B2和C2基因亚型标准序列,两基因型同源性为91.8%。在所有的样本中,与ASCs比较,CHB、LC和HCC患者的年龄普遍高,男性多且C基因型居多(ASCs C基因型比例55.1%,CHB、LC和HCC C基因型比例分别为79.0%,80.6%和86.7%)。2.根据HBV基因型B2和C2的“野生序列”,分析了相关区域66个热点变异,大部分位点的突变频率C型高于B型。C基因型中,以ASC作为对照组,A1206C是LC的危险因素;C873T、G1229A、A1314G、T1344C、T1353C、A1359G、C1362T、T1497C、C1504T、T1508A、G1512A、A1727T、A2574G是HCC的危险因素;C1338T、G1386A、T1464C、T1500C、T1544A、G1613A、C1653T、T1674C、G1719T、A1727G、G2699C是LC、HCC的危险因素;G915A、A993G、A1053G、C1218T、A1221T、G1230C、T2441C、G2699A是CHB、LC、HCC的危险因素。C基因型中,以ASC作为对照组,T929A是CHB的保护因素;A1329C是LC的保护因素;T1078G、A1329C、C1505T、A1574T是HCC的保护因素;T796G、A934C、T2465A是CHB、LC的保护因素;T1488C、C1491C是LC、HCC的保护因素;G834A、G912A、C2456T、A2558G是CHB、LC、HCC的保护因素。与CHB比较,A1206C是LC的危险因素;与LC比较,T796G、G1229A、T1344C、A1359G、T2441C、A2574G是HCC危险因素。与LC比较,G1230C是HCC保护因素。3. C基因型中,与LC比较,在HBeAg阳性患者T796G、G1229A是HCC的危险因素,G1230C是HCC保护型因素,说明HBeAg阳性比阴性LC患者发生T796G、G1229A更容易得HCC,而发生G1230C不易得HCC;与LC比较,在HBeAg阴性患者A2574G是HCC的危险因素,说明HBeAg阴性比阳性LC患者发生A2574G更容易得HCC;与CHB比较,在HBeAg阳性患者A1206C是LC的危险因素,说明HBeAg阳性比阴性CHB患者发生A1206C更容易得HCC。4.单因素及多因素回归分析表明,T796G、C1218T、A1221T、G1229A、T1344C、A2574G是HCC的独立危险因素;G912A、G1230C、C2456T是HCC的保护因素。在HCC和LC中,这8个位点并没有随着年龄增加突变频率增加;ASCs中,突变频率也没有随着年龄增加而变化。在T796G,G912A和C2456T中,ASC的平均突变频率明显高于HCC、LC和CHB组。而在C1218T, A1221T和G1230C中,ASC的平均突变频率明显低于HCC、LC和CHB组。G1229A和A2574G中,HCC平均突变频率(49.6%,38.5%)明显高于LC,CHB和ASC组(G1229A分别为32.9%,28.1%,38.6%,A2574G分别为15.2%,15.6%,21.7%)。5.分析了HCC患者的拉米夫定(LAM)耐药位点YMDD (M204V/I)变异情况。实验所用样本均是没有接受抗病毒治疗的患者,我们检测了部分HCC样本的P(polymerase)基因区739(YVDD)和741(YIDD)位点的变异情况,发现A739G变异仅为5.81%,G741T变异仅为4.65%,而拉米夫定治疗5年耐药率接近70%,说明未服用抗病毒药物的自然突变率并不高。结论1、乙肝病毒B2和C2基因亚型标准序列的异质性为8.2%。2、C基因型中,HBeAg阳性比阴性LC患者发生T796G、G1229A更容易得HCC,而发生G1230C不易得HCC;HBeAg阴性比阳性LC患者发生A2574G更容易得HCC;HBeAg阳性比阴性CHB患者发生A1206C更容易得HCC。3、C1218T、A1221T、G1229A、A2574G是HCC的独立危险或保护因素。