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胰岛素样生长因子-Ⅰ(human Insulin-like Growth Factor-Ⅰ,hIGF-Ⅰ)是一类具有细胞分化和增殖功能,并具有胰岛素样作用的多肽。它应用的范围越来越广,但是hIGF-Ⅰ供应的相对不足成了应用的的主要障碍之一。家蚕丝腺是一个高度分化的组织,具有非常强的蛋白合成及分泌能力,因此在生产基因药物方面丝腺反应器有着很好的应用前景。
为了实现转基因家蚕丝腺生物反应器实现hIGF-Ⅰ的分泌表达,提高重组蛋白表达水平,简化提取工艺,用家蚕丝胶(ser-1)启动子控制丝素重链基因fib-H信号肽和hIGF-Ⅰ融合基因构建基于piggyBac转座子的转基因载体pigA3GFP-serHS-hIGF-Ⅰ-neo,通过精子介导法导入家蚕,对筛选获得转基因家蚕进行hIGF-Ⅰ的表达水平检测。通过piggyBac转座子介导成功将fib-H信号肽和hIGF-Ⅰ融合基因表达盒整合进入家蚕基因组,并实现表达目的蛋白部分分泌进入丝腺腔并最终到达蚕丝丝胶层。在转基因家蚕G1代每克新鲜中部丝腺组织中hIGF-Ⅰ的表达水平约为43.8 ng左右,每克蚕茧中hIGF-Ⅰ的含量大约为46.7 ng左右。结果表明丝素重链基因fib-H信号肽在中部丝腺组织可引导重组蛋白的分泌表达,提高表达水平。
此外,用家蚕丝素Fhx/P25启动子驱动hIGF-Ⅰ,构建了转基因载体pigA3GFP-Fhx/P25-hIGF-ie-neo,该载体以精子介导法导入蚕卵,通过筛选并结合分子生物学鉴定,获得了转基因家蚕。通过绿色荧光观察结合采用10 mg/ml的G418筛选,PCR和点杂交鉴定,将IGF-Ⅰ转基因家蚕系多代培养,选取G8代家蚕幼虫解剖,取其后部丝腺制作冻干粉。ELISA检测结果显示G8代hIGF-Ⅰ在每克后部丝腺组织冻干粉中的表达水平为493 ng左右。通过尾部静脉注射链脲霉素(STZ)建立糖尿病(DM)小鼠模型,用后部丝腺冻干粉对其灌胃,结果 DM小鼠血糖明显下降(P<0.05)。表明转基因家蚕丝腺表达hIGF-Ⅰ具有生物学活性。