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第一部分MiRNA-133a影响血管平滑肌细胞向成骨样细胞样分化的研究目的：研究miRNA-133a(miR-133a)在小鼠血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化中的作用。方法：用Northern免疫印迹法检测miR-133a在小鼠心脏、骨骼肌、血管平滑肌细胞、胸主动脉中的表达情况。用β-甘油磷酸钠(p-sodium glycerophosphate, β-GP)诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化,Northern免疫印迹法检测miR-133a在这一过程中的表达水平的改变。观察成骨样细胞分化指标变化：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性用分光光度计检测对硝基苯酚释放获得,骨钙素(Osteocalcin, OC)用放射免疫测定法测定,而细胞经茜素红染色后,用氯化十六烷基嘧啶提取染色茜素红量化矿化结节染色。Western免疫印迹法和实时定量PCR分别检测Runx2蛋白和mRNA表达量的变化。根据miR-133a-1前体序列设计引物,退火后连接至pSilencer4.1-CMV puro载体,构建miR-133a-1的表达载体pre-miR-133a-1。将pre-miR-133a-1转染至血管平滑肌细胞,造成miR-133a过表达细胞模型,随后予10mMβ-GP诱导分化,同样方法检测ALP活性、OC分泌以及细胞中矿化结节量的变化,Runx2蛋白用Western免疫印迹法检测,Runx2mRNA表达用Northern免疫印迹法和实时定量PCR检测。结果：(1)miR-133a在心脏及骨骼肌组织中有较高水平的表达,而在VSMCs和胸主动脉中少量表达。(2)与对照组相比,β-甘油磷酸钠诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程中,ALP活性及OC分泌水平均明显增加,Runx2蛋白表达水平显著升高,且矿化结节形成也明显增多。(3)与转染了空质粒的VSMCs相比,转染了pre-miR-133a-1的VSMCs中的miR-133a表达水平显著增加,ALP的活性和骨泌素的分泌量及矿化结节的生成随着miR-133a的过表达而明显下降。miR-133a的过表达抑制了Runx2蛋白的表达,而Runx2mRNA的表达水平却未受影响。结论：用pSilencer4.1-CMV puro质粒构建成功miR-133a-1表达载体,转染该载体可以使miR-133a在血管平滑肌细胞内稳定地高表达。过表达miR-133a抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化。第二部分MiR-133a调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的机制研究目的：预测并验证miR-133a作用的靶基因,为防治动脉钙化提供理论依据。方法：用多个靶基因预测软件分析得到miR-133a作用的靶基因。PCR扩增包含靶位点在内的靶基因3’-UTR,PCR扩增靶基因3’-UTR全长cDNA,连接到pcDNA3.1(+)载体构建野生型靶基因3’-UTR表达载体,以此为模板,用QuickChange site-directed mutagenesis试剂盒靶基因3’UTR中引入三个碱基突变,构建突变型靶基因3’-UTR表达载体,这两个载体分别与pre-miR-133a-1或miR-control共同转染,加p-GP诱导分化,观察靶基因蛋白表达,靶基因蛋白表达用Western免疫印迹法检测。结果：(1)软件预测Runx2为miR-133a作用的靶基因。(2)转染入含突变型Runx23’-UTR结合位点的载体可以消除pre-miR-133a-1对Runx2蛋白表达的抑制,提示在向成骨细胞样分化的过程中,Runx2是miR-133a重要的作用靶点。结论：(1)Runx2基因是miR-133a的靶基因。(2)只有miR-133a与Runx2的3’UTR同时存在且正常时,miR-133a才能与Runx2的3’UTR结合,对Runx2蛋白的产生发挥反向调节作用。