土壤拮抗放线菌P3-2的筛选鉴定及其发酵液中抑菌成分的分离研究

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自第一次于微生物中提取出青霉素以来,微生物就一直成为抗生素的主要来源,而放线菌是产生抗生素的最大一类微生物,目前从微生物中分离的抗生素有60%以上为放线菌的次生代谢产物,小部分来自真菌和细菌。土壤是放线菌的主要栖息场所,不同地质条件,气候环境下的土壤进化出了丰富多样性的放线菌种群。而我省地处云贵高原,其地理气候与生态环境独特多样化,据调查我省土壤中产抗生素的放线菌的研究还是空白,因此有着巨大的研究开发前景。  本研究通过对贵州各地的土壤进行拮抗放线菌的筛选,筛选出两株对植物病原真菌和细菌有着高拮抗性的放线菌:P3-2与P2-35。以放线菌 P3-2为材料,从抗菌谱,发酵液稳定性,菌株分类鉴定,主要活性次生代谢产物分离纯化和结构鉴定进行了系统研究,其主要研究结果如下:  1.通过土壤中放线菌的分离纯化,得到256株菌株,采用抑制菌丝生长速率法对256株菌株发酵液进行生物活性初筛,筛选到10株活性较好的菌株,将这10株菌株进行纯化得到的孢子纯菌株后,再对其发酵液复筛,得到两株编号为P2-35、P3-2的菌株,其发酵液对供试植物病原菌的抑制效果都非常好,P3-2菌株10倍稀释发酵液对油菜菌核病菌,黄瓜灰霉病菌,小麦赤霉病菌,水稻纹枯病菌,半夏立枯病菌的抑制率都高达99%。两种放线菌的抗菌谱研究表明他们的次生代谢产物具有广谱抗菌性。  2.对放线菌 P3-2发酵条件进行了优化,并对其发酵液稳定性进行了研究,结果表明,发酵液中抗菌活性物质对温度及光照不敏感,对酸稳定,仅在碱性条件下稳定性稍差,菌株传代10次后遗传学稳定。发酵的最佳条件为,种子培养两天后,将培养好的种子培养液以10﹪(V/V)接种到小米发酵培养基中。28℃,170rpm培养3天后再以10﹪(V/V)的接种量接种到新的小米发酵培养基中(pH7),其中装液量为250ml的三角瓶中每瓶装量100ml,28℃,170rpm摇瓶发酵3天后过滤。  3.利用多项分类法,完成了菌株 P3-2的形态特征鉴定、生理生化指标测定和16S rDNA的序列分析。放线菌菌株 P3-2的16S rDNA序列长度为1456bp,GeneBank登陆号为HM002750。P3-2菌株与模式菌株 Streptomyces recifensis ST100的序列同源性高达99.4%。但是在对菌株 P3-2的培养特征和生理生化特性的研究中发现,与模式菌株Streptomyces recifensis ST100相比多项指标都存在着许多的不同。推测菌株 P3-2可能为链霉属中Streptomyces recifensis ST100的一个近缘种。将其命名为Streptomyces sp.P3-2。  4.作者经过2次硅胶柱层析,一次快速反相 C-18硅胶柱层析和制备高效液相,并在分离中都采用活性追踪的技术,成功的在菌株 P3-2发酵液中分离出3个具有抑菌活性的纯化合物。其中化合物 WJF-0197mg,WJF-0210mg,WJF-032mg。由于化合物WJF-02与WJF-03分离的量较小,没有做结构分析,只是用来做标准化合物,为以后课题组的其他人分离提供依据。对化合物 WJF-01的结构进行了1H NMR、13C NMR、DEPT90、DEPT135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、质谱(MS)、元素分析和红外光谱表征,鉴定其结构为2-(1,4-环己二烯基)乙酸。
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