禾谷镰刀菌中FgWhi2蛋白的生物学功能研究

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由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病是一种全球性的真菌病害,在全球小麦种植区均有发生。该病害不但会造成小麦产量和品质的严重下降,还会在侵染小麦籽粒过程中分泌并累积脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)等真菌毒素。人畜误食后会引起眩晕、发烧、腹泻等急性中毒症状,降低机体免疫能力与生育能力,严重威胁人畜健康。我国是世界上小麦种植面积最大的国家之一,小麦的高产和稳产直接关系着我国的粮食安全,因此防止小麦赤霉病的暴发是保障我国粮食安全的重要手段之一。在研究酵母菌细胞周期阻滞基因时,发现Whi2与该过程相关,并且参与细胞的一系列应激反应。在植物病原菌炭疽菌和稻瘟菌中,Whi2还参与病原菌致病性的调控。课题组前期在禾谷镰刀菌中鉴定到了酵母Whi2的同源蛋白Fg Whi2。通过蛋白多序列比对以及系统进化分析,发现Whi2蛋白在真菌中较为保守,因此具有比较保守的生物学功能。进一步通过RNA-seq数据分析,发现尽管Fg WHI2基因在在禾谷镰刀菌的有性生殖、营养生长、病原菌侵染小麦穗和毒素合成过程中均有表达,但Fg WHI2表达水平较低。本研究通过PEG介导的同源重组方法进行目的基因的敲除(Splik-marker),获得Fg WHI2敲除突变体,同时构建Fgwhi2突变体的互补菌株。通过系统比较Fgwhi2突变体与野生型菌株和互补菌株的表型差异,揭示了Fg Whi2在禾谷镰刀菌中的生物学功能。主要结果如下:1、相较于野生型菌株PH-1,Fgwhi2突变体在PDA平板上菌落生长速率显著减缓、气生菌丝较短。进一步发现Fgwhi2突变体对氧化胁迫以及细胞壁胁迫的敏感性均显著下降;2、在羧甲基纤维素钠(CMC)培养基中摇培,发现Fgwhi2突变体产孢量下降。进一步观察发现其分生孢子变短,隔膜减少,并且分生孢子的萌发速率也显著降低。通过亚细胞定位,发现在分生孢子和菌丝细胞中Fg Whi2主要定位于细胞隔膜、细胞质膜与液泡中;3、在观察有性生殖过程中,发现Fgwhi2突变体不能形成子囊壳或子囊壳前体,表明其有性生殖能力丧失;4、Fgwhi2突变体对小麦穗部和小麦胚芽鞘的致病力均显著下降,同时DON毒素合成量也明显下降;5、通过Western blot检测,发现Fg WHI2基因的缺失会显著增加Fg Atg8降解速度,表明Fg Whi2负调控了细胞的自噬水平;6、通过Pull Down质谱数据分析鉴定到多个Fg Whi2互作蛋白,包括FGRRES_05940、FGRRES_03319、FGRRES_05187_M、FGRRES_05713_M、FGRRES_06576_M、FGRRES_09471。综上所述,Fg Whi2对禾谷镰刀菌的菌落生长、无性生殖、有性生殖、胁迫应答、植物侵染、DON毒素合成、细胞自噬调控等过程具有重要作用。
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