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洋葱（Allium cepa L.）属百合科葱属,是严格的二年生植物,在适合的光周期下,当年形成鳞茎,经冬贮春化后,第二年再经适合光周期成花结实,从而完成生命周期。植物光周期调控涉及到众多调控元件,如光敏色素（PHYA,PHYB）,隐花色素（CryC）,时钟节律元件（CDF）及信号输出元件CO等。在植物的光周期调控通路中,光感受器（如光敏色素、隐花色素）接收光信号,通过信号转导形成胞内第二信使系统的级联传递来调节光形态建成反应。模式植物中的研究表明,COP是一个光形态建成的抑制剂,在拟南芥的多种光介导发育过程中起着中枢调节的作用,包括开花和下胚轴生长调控等。COP的丰度和活性对正常植物的发育是必不可少的,而且是CO-FT开花调控途径的中心抑制因子。而时钟调节通路则协调许多对光周期和温度变化的发育过程,其中较为主要的是CDF-FKF1调控元件,其中CDF基因作为内生节律基因,对植物发育和生理的协调不仅限于开花和下胚轴伸长,还涉及到耐寒和耐旱等多种逆境调节。COP及CDF可以抑制光周期调控途径中的CO/FT调节元件的昼夜节律和光周期信号转录水平,抑制植物开花,而且贯穿整个植物生命周期的诸多相互调节的输出途径。本研究克隆了洋葱的AcCOP10,AcCDF2基因,研究其表达模式,构建植物表达载体,并通过转基因植株的表型变化分析其功能,分析转基因拟南芥植株中上下游基因表达量的变化,明确COP10及CDF2基因的功能,进一步完善了洋葱开花网络,试验结果总结如下:主要试验结果如下:（1）依据洋葱转录组测序结果设计引物,克隆了AcCOP10基因（KY419117）和AcCDF2基因（KY406741）。AcCOP10基因全长CDS为531 bp,推测编码176个氨基酸序列;AcCDF2基因全长CDS为852 bp,推测编码283个氨基酸序列。软件分析结果显示,COP10氨基酸比对的一致性为68.88%,有连续的WD40重复序列。CDF氨基酸比对的一致性为52.20%,具有明显的高度保守的C2-C2 DOF结构域。（2）进化树分析表明,AcCOP10与油棕（XP019706701.Elaeis guineensis）在一个大的分枝,AcCDF2与石斛（XP020692973.1 Dendrobium catenatum）亲缘关系较近,且几种典型的单、双子叶植物聚类在不同分枝,可能是由于长时间的生物过程的多样性参与导致CDFs在进化过程中发生了适应于自身的变化,出现特定的分化,但还是保留了相似的锌指结构域。（3）用荧光定量PCR检测AcCOP10,AcCDF2的时空表达特性,结果表明AcCOP10在未抽薹的叶鞘中表达较高,其次在抽薹后盛花期的花中表达量较高。AcCDF2在未抽薹的幼叶中表达量最高,其次在抽薹后盛花期的花中也有较高表达,除此,在其它部位表达量都很低。（4）分别构建2个基因的过表达载体pAcCOP10-OX和pAcCDF2-OX和RNAi载体pAcCOP10-RNAi,以冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中。采用花序浸染法转化哥伦比亚野生型拟南芥。2个基因过表达株系与野生型表型相比,莲座叶数增多,植株长势稍矮化,开花时间推迟。转pAcCOP10-RNAi干扰植株表现为开花提前、分蘖数目增多。（5）将AcCOP10过表达载体转化拟南芥cop10突变体（SALK0889930）,转化株花期被严重抑制,对光周期不敏感,难以感受光信号来调节植株从营养生长到生殖生长的转变。为了确定转基因植株晚花表型上的改变是否是由于时钟控制的开花时间基因的变化所致,我们分析了转基因株系中CO和FT表达量的变化,与野生型及突变体植株进行了比较。cop10突变体与WT相比,CO和FT表达水平显著升高,进而导致突变体植株早熟开花。与cop10突变体相比AcCOP10-ox-cop10株系中表达量受到严重抑制,转突变体株系CO表达量显著地低于突变体,同时也显著地低于野生型植株,而FT表达量虽然显著地低于突变体,但与野生型差异并不显著,说明AcCOP10能够恢复cop10突变所引起的早花现象,与拟南芥的COP10基因具有同样的调节下游光周期响应基因,进而调节开花的功能;AcCOP10-ox-WT株系中CO表达量较WT低,差异显著,而FT的表达量仅较WT稍低,差别较不明显,说明洋葱的AcCOP10可造成拟南芥的晚花,这种晚花是通过下调CO表达来实现的,且该途径可能并未经过FT。为进一步研究COP10的调控途径,对cop10春化及未春化突变体FLC的mRNA水平进行分析发现,与WT相比突变体中FLC的表达受到显著的抑制。说明COP10可能通过调控FLC的表达来参与春化及自主途径中的开花。AcCDF2过表达载体分别转化拟南芥cdf 1突变体（CS476144）,cdf5突变体（SALK044252C）,转基因植株恢复了生物钟缺失突变体植株的不良表型,改善了植株对环境的适应能力,延长了生命周期,推迟了开花时间,说明AcCDF2参与调控生物钟相关途径,而AcCDF2可能在开花植物的过渡过程中发挥了独特的作用,转基因株系中CO和FT的表达受到抑制。说明AcCDF2可能作为关键的负调节器从而产生精准调控CO-FT表达的机制。（6）为探讨洋葱AcCOP10,AcCDF2在植物开花调控中与上下游基因的相互关系,分别将2个基因过表达载体转化拟南芥gi突变体（CS181）,均出现植株高度矮化,莲座叶数量增加,发育迟缓,开花延迟的现象,说明2个基因均与GI存在互作关系。与gi突变体植株相比,AcCOP10-ox-gi株系和AcCDF2-ox-gi株系开花时间延后,CO和FT的表达量较野生型植株显著降低。结合拟南芥上的研究结果,确证AcCDF2位于GI下游,而AcCOP10转gi突变株虽然也有晚花表型,但明显弱于转cop10突变株的表型,因此推测AcCOP10与GI并行调控植物开花。（7）对转过表达载体pAcCDF2-OX植株,WT和cdf5突变体进行干旱胁迫处理,发现干旱条件下,AcCDF2-ox-cdf5株表现虽然和WT相似,均为严重失水和严重萎蔫症状,但其存活率高于WT,而cdf5突变体完全枯死,说明转基因突变体植株一定程度上恢复了功能缺失突变体的耐受性,提高了植株的存活率。AcCDF2-ox-gi转基因植株和gi突变体受到的影响较小,保持了健康的绿叶,存活率较高,其中AcCDF2-ox-gi株系中只有少许叶片发生黄化萎蔫的状态。干旱胁迫响应基因Gols2在转基因株系中均发生不同程度上调,说明AcCDF2促进Gols2基因的表达,可能作为干旱胁迫途径中的激活因子,提高植株的抗旱能力。（8）为验证AcCDF2是否响应抗冻性胁迫,发现无论是否经过冷驯化处理,cdf5突变体植株的耐冷能力都明显受损,表现出较低的抗冻性。与未驯化的WT及突变体植物相比,AcCDF2-ox-gi,AcCDF2-ox-WT植株均表现出较高的抗冻能力,存活率较高,AcCDF2-ox-cdf5植株恢复了突变体的抗冻性差的表型,对极端温度环境的适应力增强。此外,低温驯化后AcCDF2-ox-gi,AcCDF2-ox-WT仍旧有较强的耐寒能力,其中AcCDF2-ox-gi植株耐寒性比其它转基因株系更强,AcCDF2-ox-cdf5适应能力较WT弱一些。对抗冷途径枢纽基因CBF1的mRNA水平进行分析发现转基因株系中CBF1基因发生上调,说明AcCDF2可能是低温胁迫途径中的上游激活因子,直接或间接作用于胁迫调控的靶基因的表达。（9）黑暗处理后观察光形态发育表型,WT表现为子叶较小,下胚轴长度适中;cop10突变体表现为下胚轴强烈抑制表型,子叶开放;AcCOP10-ox-cop10株系下胚轴长度与WT相近,但子叶展开仍旧稍大于WT;AcCOP10-ox-gi株系及AcCOP10-ox-WT株系表型相似,均表现为子叶展开较小,下胚轴伸长表型显著。说明AcCOP10可以独立于光照通过不同的机制在黑暗中促进下胚轴伸长。转AcCOP10基因植株中Hy5的表达发生不同程度的下降,且在cop突变体中Hy5的表达显著上升。说明AcCOP10可能通过降解Hy5的表达来促进植物下胚轴的伸长。