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半夏(Pinellia ternata)属于天南星科(Araceae)植物,是重要的传统中药。近年来本实验室从浙江省农业科学院蚕桑研究所的半夏病叶中分离出与大豆花叶病毒相关的半夏病毒(SMV-P),这是SMV侵染天南星科植物的首次报道。SMV-P的P1基因与大豆花叶病毒的同源性很小,而与芋花叶病毒(DsMV)的相似性却达到60%左右。我们采集了14个地区的半夏,发现浙江省农业科学院蚕桑所、上海植物园、湖北省武汉植物园、湖北省武汉市华中农业大学、河南省禹州市和江苏省盐城市射阳县6个地区的半夏有SMV-P的侵染。通过测定这些分离物的P1基因序列发现各种半夏中的SMV-P P1基因序列并没有十分明显的地区差异,并且上述6个地区的SMV-P分离物的P1基因序列均与DsMV有较大的同源性(约为60%),而与SMV的各种大豆分离物的同源性均很小(核苷酸38.3%-45.2%,氨基酸23.7%-31.9%)。这说明这种现象普遍存在于大豆花叶病毒半夏株系的病毒基因组中,暗示SMV-P可能是SMV与DsMV的P1基因重组的产物。 本研究以pGEX-3X为表达载体,构建了SMV-P P1基因及6K1基因的原核表达载体,在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysE中大量表达,并免疫小鼠制备特异性抗血清。制备的SMV-P P1蛋白抗血清用于后续实验的SMV-P P1蛋白的检测,而6K1蛋白抗血清用于半夏病叶中的6K1蛋白的免疫胶体金标记。 构建了酵母双杂交载体pGBKT7-(SMV-P)P1,并成功转入酵母菌AH109。Western blot分析表明SMV-P的P1蛋白在酵母体内与BD蛋白融合表达,并排除对宿主细胞的毒害和自激活作用,可用于酵母双杂交文库的筛选。 用Trizol提取半夏总RNA,应用SMART技术合成第一链cDNA,然后用5’和3’PCR引物进行LD-PCR扩增双链cDNA,并与pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187,构建半夏的酵母双杂交cDNA文库。经检测,所构文库的独立克隆数为2.1×10~6,文库滴度为3.1×10~8,可作为文库用于筛选。 将文库菌Y187与AH109/pGBKT7-(SMV-P)P1接合后根据对3个报告基因ADE2、HIS3、MEL1的检测筛选了4个阳性候选克隆。抽提阳性候选克隆的质粒,PCR检测文库质粒,结果4个阳性候选克隆的插入片段大小约为600bp左