病毒广泛存在于自然界中,无时无刻都在威胁着人类的生命健康安全,对病毒进行快速、精准的检测对防止疾病传染和阻止疫情爆发具有重要意义。针对病毒的核酸检测是判断病毒存在的金标准,目前已有许多基于荧光方式（如实时荧光PCR）的检测平台被应用于病毒的高灵敏、高特异性检测。然而,现有荧光检测方法大多需要对报告分子进行额外的荧光基团标记,使其应用受到一定局限。基于免标记的荧光检测方法可以有效降低背景信号,且能简化试剂制备过程和降低成本,甚至可用于特殊场景下的原位检测,具有很强的应用价值。基于此,本论文基于G-三链体（G3）和G-四链体（G4）发展了两种核酸免标记检测新方法,并进一步结合微流控芯片技术建立了操作方便快速的核酸免标记检测平台,具体研究内容如下:1.本论文发展了一种基于G3和硫黄素T（ThT）的报告分子体系用于RNA靶标的免标记检测。虽然人端粒G4（ht-G4）已被广泛研究与使用,但研究ht-G3传感性能的报道甚少。首先,论文作者证明了 ht-G3可以显著增强ThT的荧光。其次,基于ht-G3序列设计了一种能形成发卡结构的DNA分子信标（ht-G3MB）,它在没有靶标时可以限制ht-G3空间结构的形成;而当靶标存在时,发卡结构被打开,ht-G3空间结构形成,从而使ThT荧光显著增强,且增强幅度与靶标浓度变化成正比,灵敏度可达1 nM,并证明了该方法的特异性。最后,为进一步提升该方法的检测灵敏度,论文作者在系统中引入双特异性核酸酶（DSN）以剪切与靶标互补配对的DNA,使靶标RNA可以循环使用以达到扩大信号的目的,最后使灵敏度提高了 100倍,达到0.01 nM。该基于ht-G3/ThT的免标记检测策略有望广泛应用于RNA检测。2.本论文发展了一种基于ht-G4/ThT和CRISPR/Cas12a的DNA免标记检测新方法。论文作者所在课题组报道了 CRISPR/Cas12a可以反式剪切G4。基于此,本工作通过条件筛选确认了最佳的G4序列（ht-G4）和离子条件,当Cas12a被靶标激活时可以高效地对G4进行剪切,利用G4空间结构的破坏使ThT荧光大幅减弱消失,据此实现靶标的免标记检测。利用该Cas12a-G4/ThT方法,本论文进行了 HPV18质粒的检测,结果表明灵敏度可达0.1 nM;这一效果与荧光报告分子在同等检测体系下的灵敏度相同,具有重要的应用价值。3.本论文进一步提出了一种免光刻快速制备微流控芯片的方法,并将该方法制备的微芯片与上述Cas12a-G4/ThT检测方案联用实现了 HPV18的免标记检测。常规所使用的微流控芯片一般在超净间通过复杂的工艺（如光刻、显影等）制备出光刻胶阳模,再进一步获得PDMS芯片,其阳模加工时间长、成本高,不利于普及至普通的生化实验室使用。本论文使用激光切割机在透明胶带上烧蚀出微图案,并将胶带转移至硅片上,再将正光刻胶滴加至微图案处,抹平、加热即可在5min左右制备出阳模,进而快速获得PDMS芯片装置。由于切割胶带所需的能量很小,该方法制备的微通道分辨率可达100 μm。此外,通过改变胶带的类型和层数,可以很容易地控制阳模的高度。在充分证明该方法所制备的PDMS芯片件可与生化反应兼容后,作者进一步将其用于HPV18的免标记检测,结果表明该芯片可通过一步操作完成检测反应。本章节所发展的微流控芯片免光刻制备方法成本低、操作简单、时间短,且所制备的器件与各种常规生化实验兼容,有望广泛应用于一般生化实验室。综上所述,本论文研究了 ht-G3对ThT荧光增强的特性,并利用这一特性构建了 RNA靶标的免标记检测方法;进一步,结合ht-G4/ThT与CRISPR/Cas12a实现了 DNA靶标的免标记检测;最后,发展了一种免光刻制备微流控芯片的方法,并将其用于HPV18的快速检测。上述免标记的核酸检测方法,有望拓展到生活中病毒快速、低成本的检测。