腹泻是生猪养殖过程中常见的疾病,不同年龄段的猪均可发病,轻者影响猪的生长发育,严重时可导致猪的死亡,给养殖业带来巨大的经济损失。病毒性腹泻是造成猪腹泻的主要因素之一,而冠状病毒科（Coronaviridae）成员是常见的引起猪腹泻的病毒,包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）等。此外,还有一些常被忽视的可引起猪腹泻的潜在病毒,如猪凸隆病毒（PToV）,该病毒属于凸隆病毒科（Tobaniviridae）,凸隆病毒属（Torovirus）成员,具有与冠状病毒相似的基因组结构和组成。本研究针对PToV开展流行病学调查,同时建立多重RT-PCR和RT-qPCR临床检测方法,旨在为猪病毒性腹泻病的防控提供技术手段。1.PToV的流行病学调查及遗传进化分析本研究对2017至2019年采集自我国河南省、广东省、安徽省和江苏省的307份猪腹泻样品进行PCR检测,结果显示18份为PToV 阳性,阳性率为5.9%。共感染分析结果表明,PToV 阳性样品与PEDV、PDCoV、猪捷申病毒（PTV）和猪萨佩罗病毒（PSV）的共感染率分别为38.9%、5.6%、27.8%和16.7%。对阳性样品进行基因组扩增,最终获得5条全基因组、9条S蛋白基因和17条HE蛋白基因序列,将以上序列与公共数据库中现有毒株序列进行遗传进化分析,结果显示,本次新获得的PToV全长序列之间的核酸相似度为95.0%-99.7%,均属于同一进化分支（Clade）。基于S基因,HE基因和全基因组的系统发育树均能将PToV分成两个分支。基于不同基因进化树的拓扑结构差异,我们进行对全基因组进行了重组分析,结果表明PToV的HE基因和S基因中存在广泛的基因重组现象。以上结果揭示了我国PToV的流行情况和病毒的遗传多样性,丰富了 PToV的基因组数据,为病毒的研究和疫病的防控和提供了科学依据。2.用于同时检测PToV等五种致猪腹泻病毒的五重RT-PCR检测方法的建立本研究设计了能够同时检测PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV和TGEV的5组特异性PCR引物,并进一步对反应的退火温度和引物浓度进行优化,使其具有良好的灵敏性,特异性和重复性。结果该方法能够成功检测最小浓度为1×103拷贝/μL的单一或者混合的质粒标准品,能够精准地检测出29种模拟共感染案例并且对于其他的猪源病毒无非特异性扩增。应用所建立的五重RT-PCR检测方法对87份临床样品进行检测,结果显示该方法与单重RT-PCR检测结果的符合率为100%,表明该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。3.用于同时检测PToV等四种致猪腹泻病毒的四重荧光定量PCR检测方法的建立此外,本研究还开发了一种用于同时检测PEDV、PDCoV、PToV和SADS-CoV的四重TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法。基于现有的相关序列信息,我们设计了四组特异性引物和探针,并通过调整引物和探针的终浓度来优化荧光信号强度,从而得到最佳的反应体系。结果表明,该四重检测方法能够稳定地检测最低浓度为1×102拷贝/μL的单一或混合的质粒标准品,能够适应各种模拟共感染的情景,同时表现出很好的稳定性。用该方法对101份临床样品进行检测,结果与单重RT-PCR的检测结果的一致率为100%。综上所述,本课题调查研究了我国中部和东南部省份PToV的流行情况及遗传进化规律,同时建立了两种致猪腹泻病毒的多重检测方法,为猪病毒性腹泻病的流行病学调查、临床检测、疾病的防控和监测提供了可靠有力的工具。