论文部分内容阅读
抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX,EC1.11.1.11）,也叫做维生素C过氧化物酶,它属于末端氧化酶的一种,主要存在于高等植物、真核藻类及某些蓝细菌中,但在某些昆虫中也检测出到该酶活性。APX是清除H2O2的关键酶,对于保护叶绿体和其他细胞组分免受H2O2及其所产生的羟自由基的破坏是必不可少的。当植物体内的H2O2积累时,能快速诱导APX表达,APX催化抗坏血酸与H2O2反应,使H2O2被分解。APX在植物的抗氧化胁迫中起重要作用。在高等植物中,APX是一个多基因家族,它的同工酶定位于4个不同的区域:叶绿体中的基质APX（sAPX）、叶绿体类囊体膜APX（tAPX）、微体APX（mbAPX）和胞质APX（cAPX）。水稻APX基因家族共有8个成员分为3种类型:细胞质型APX（APX1,2）;过氧化物体型APX（APX3,4）;叶绿体型APX（APX5,6,7,8）。其中细胞质型APX（APX1,2）的研究较多。其它类型研究较少,本实验以水稻的过氧化物体型APX（APX3,4）为主要研究对象。以粳型水稻的cDNA为模板,根据Genbank数据库水稻APX3（AY382617）、APX4（NM001068974）序列,分别设计特异引物PCR扩增出目的片段,回收并与pMD18-T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α,蓝白筛选获得阳性克隆。重组质粒经酶切鉴定后,测序,结果表明所得APX3序列大小为1038bp, APX4序列大小为997bp,与原序列相似性达99%以上。生物信息学推定APX3编码的蛋白大小为32.075KD,而APX4编码的蛋白大小为31.738KD,二蛋白大小相差0.337 KD; APX3的等电点为8.26,是碱性蛋白质,而APX4的等电点为7.74,为偏中性蛋白质;APX3的疏水平均值为-0.371,APX4的疏水平均值为-0.297,二者均是亲水性蛋白质;在稳定性方面APX3的不稳定系数为46.22,是一种不稳定的蛋白质,而APX4的不稳定系数为34.55,是一种稳定蛋白;二蛋白质的二级结构差别较大,只有α-螺旋都含有101个,而随机卷曲螺旋及β-螺旋相差较多;但它们的三级结构比较相似氢键差2个,α-螺旋与β-螺旋都相同,转角差1个。由此可见,水稻APX3与APX4基因以及编码的蛋白质存在着细微的差异,但APX家族基因功能相同。为了验证APX基因的功能,构建了植物的表达载体。根据APX3、APX4基因序列分别设计带有XbaⅠ、SacⅠ两种酶切位点的正、反义引物,扩增出带酶切位点的APX3、APX4基因cDNA全长并连接到已被XbaⅠ、SacⅠ酶切过缺失GUS的植物表达载体pBI121上,分别构建了含有APX3、APX4基因cDNA全长的正、反义植物表达载体pBI121-APX3、pBI121-APX4、pBI121-AsAPX3、pBI121-AsAPX4。并将其转化到农杆菌EHA105,用于下一步遗传转化。利用农杆菌介导叶盘转化法,分别将APX3、APX4基因转入模式植物烟草中。在卡那霉素选择压下生长的转基因烟草,经过基因组DNA PCR初步鉴定结果证明,外源基因整合入受体烟草基因组中,且转化效率较高,获得转APX3基因10株,转APX4基因11株。构建的目的基因的反义表达载体pBI121-AsAPX3、pBI121-AsAPX4用于下一步验证基因功能。