人偏肺病毒（HMPV）是2001年首次由荷兰学者从患者呼吸道分泌物中分离发现的，根据其病毒基因序列分析，HMPV属于副粘病毒科肺病毒亚家族偏肺病毒属。全球的流行病学调查显示，HMPV在世界范围内呈现流行趋势，易感人群为婴幼儿、免疫功能受损的儿童及老年人，5岁以下的儿童100％感染过HMPV。与呼吸道合胞病毒（RSV）类似，HMPV可引起的临床症状包括轻微的上呼吸感染、支气管炎、肺炎、毛细支气管炎等等。在儿童患者中，HMPV是仅次于RSV的引起肺炎等严重下呼吸道感染的第二位病原体。近年来，HMPV引起严重的呼吸道感染， HMPV与其他病毒协同作用产生的严重后果，HMPV给移植后患者带来的致死性感染等问题也越来越多的引起了研究人员的重视。在我们逐渐认识到HMPV给易感人群尤其是婴幼儿带来的严重危害时，实际上我们对这一种肺病毒家族的新成员了解的并不多。HMPV的感染机制，HMPV与宿主间的相互作用等并未研究清楚，目前也并无有效的疫苗可用于临床预防。因此我们想通过研究病毒的入胞机制了解HMPV与宿主细胞的相互关系，以期为后续的疫苗研究及防御措施等提供思路。进入宿主细胞是病毒感染发生的第一步。目前公认的病毒入胞方式主要有两种：膜融合与胞吞。膜融合是病毒通过特异性受体与细胞表面结合，其病毒包膜与细胞膜发生融合，并将其遗传物质传递入细胞。胞吞是指病毒结合到宿主细胞后，病毒颗粒作为一个整体借助内吞小体进入细胞的过程。对于有包膜病毒，膜融合是常见的入胞方式。但是随着研究手段的多样化，许多病毒都有新的入胞方式被发现。以RSV为例，至今已发现RSV可通过膜融合、巨胞饮、网格蛋白介导的胞吞（CME）等途径进入不同的宿主细胞。因此这也给了我们提示，对于HMPV的入胞方式我们能否有新的认知。本研究旨在探讨HMPV的入胞机制，通过了解HMPV进入宿主细胞的方式，为未来HMPV的防治提供新的研究思路。本研究分为三个部分：　　第一部分：人偏肺病毒的制备、纯化及病毒基因拷贝数检测方法的建立。　　目的：建立稳定的人偏肺病毒制备系统，培养并扩增HMPV病毒，通过蔗糖纯化获得高浓度的HMPV病毒颗粒，为后续研究HMPV入胞实验奠定基础。建立HMPV病毒基因拷贝数检测方法，为临床及后续实验检测HMPV感染率提供简易的分析方法。　　方法：HMPV接种易感细胞Vero E6，于37℃，CO2孵箱中培养4-5天，每日观察细胞病变CPE或GFP表达，待细胞病变或GFP阳性率达到峰值时，收取病毒上清。利用优化的35%蔗糖梯度离心法纯化病毒。采用TCID50方法测定病毒滴度。构建HMPV F基因质粒标准品，采用Real-time PCR方法检测HMPV病毒基因拷贝数。　　结果：Vero E6细胞生长状态良好，倍增速度快。接种HMPV00或者HMPV00-GFP后，培养至第4天或第5天，约80-90%的细胞可见CPE或GFP表达。经蔗糖梯度离心纯化后，HMPV00株病毒滴度可达到1.8×106 PFU/ml、HMPV00-GFP病毒滴度可达到1.1×107 PFU/ml。采用Taqman荧光探针法可特异性检测低至3.3×103 copies/ml的病毒核酸。　　结论：成功建立了稳定的人偏肺病毒增殖及纯化系统。成功建立了低拷贝数HMPV病毒基因的检测系统。　　第二部分：两种入胞机制-膜融合和胞吞方式在人偏肺病毒入胞过程中的确定及胞内pH对人偏肺病毒感染率的影响。　　目的：研究人偏肺病毒进入Vero E6及LLC-MK2两种宿主细胞的过程中是否有膜融合及胞吞入胞方式的共同参与，并分别确定每种入胞方式所占的比例，对人偏肺病毒入胞机制进行初步探讨。同时研究胞内低pH环境对人偏肺病毒感染率的影响，探讨pH参与HMPV胞内运输的作用。　　方法：采用间接免疫荧光的方法，检测特异性抗HMPV融合蛋白抗体和特异性抗HMPV核蛋白抗体在感染宿主细胞内的分布，研究HMPV入胞过程是否有胞吞方式的参与。利用脂溶性膜染料R18标记的HMPV病毒感染细胞，借助激光共聚焦显微镜和多功能酶标仪实时监测R18荧光强度的变化，研究HMPV入侵宿主细胞的过程是否有膜融合的发生。同时选择一对荧光染料DiOC/R18共同标记病毒包膜，利用荧光共振能量转移原理，在激光共聚焦显微镜下观察DiOC/R18-HMPV感染过程中细胞内融合事件的发生。利用pH指示剂Cy3/CypHer5共同标记病毒，使用共聚焦显微镜检测标记后的病毒荧光变化，通过两种荧光强度比例来检测病毒在胞内经历的pH变化。用胞内酸化抑制剂氯化铵及巴甫洛霉素处理易感细胞后，接种HMPV00-GFP，培养24小时后检测细胞中GFP阳性率，研究酸化抑制剂对HMPV感染率的影响。　　结果：利用间接免疫荧光方法发现，感染HMPV后，病毒融合蛋白（F）及病毒核蛋白（N）共同定位于Vero E6和LLC-MK2细胞中，这说明HMPV病毒颗粒是以完整的形式进入宿主细胞的。证明HMPV入胞的过程中存在胞吞的方式。在病毒感染2 h后，两种细胞中FN蛋白共定位荧光分别占总N蛋白荧光的68.17%和83.88%。说明感染2 h后，约有2/3和4/5的HMPV病毒颗粒是被胞吞入胞的。R18融合实验发现R18反淬灭百分比DQ%约为30%，即约有1/3的HMPV通过膜融合的方式感染两种宿主细胞。DiOC/R18共染实验发现HMPV入胞过程中，融合事件不止是发生在易感细胞的表面，同时也发生在细胞内部。说明HMPV感染Vero E6和LLC-MK2细胞时，既有膜融合的方式，也有胞吞方式的存在。在HMPV感染的2 h内，胞内低pH指示剂荧光染料CyPher5的荧光强度逐渐增加提示HMPV在宿主细胞内经历了pH降低的过程。胞内酸化抑制剂巴弗洛霉素和氯化铵处理细胞后，HMPV感染率在Vero E6和LLC-MK2细胞中分别下降至48%、61%和59%、43%，说明了HMPV感染的发生需要依赖胞内低pH。　　结论：人偏肺病毒进入Vero E6和LLC-MK2两种宿主细胞的过程中同时有膜融合和胞吞方式的参与，并且以胞吞方式为主。HMPV在LLC-MK2细胞内转运过程需要低pH的帮助，胞内低pH有利于HMPV感染的发生。　　第三部分：Clathrin及Caveolae介导的胞吞途径在人偏肺病毒感染宿主细胞中的作用。　　目的：确定具体是哪一种胞吞途径参与了人偏肺病毒的入胞过程，更加深入的研究其入胞机制相关分子，为防御病毒入侵、病毒疫苗研究提供科学的依据。　　方法：利用一系列针对网格蛋白（clathrin）的化学阻断剂如氯丙嗪、Pitstop，针对膜穴样凹陷（caveolae）途径的化学阻断剂如甲基环糊精、菲律宾菌素，和胞吞途径的非特异性阻断剂如细胞松弛素D、金雀黄酮等，以及针对相关基因CLTC、CAV等的小干扰RNA预处理易感细胞，然后再接种HMPV00-GFP。病毒感染24小时后，收集细胞，用流式细胞术检测细胞GFP阳性表达率。分析比较各个阻断剂处理组与未加药物的对照组GFP阳性率的差异，研究各种阻断剂对病毒感染率的影响，从而确定哪一种胞吞途径对HMPV感染宿主细胞的贡献最大。　　结果：利用网格蛋白的阻断剂CPZ、Pitstop，膜穴样凹陷的阻断剂MβCD作用Vero E6和LLC-MK2两种细胞后，HMPV00-GFP的感染率均有不同程度的下降。其中MβCD对HMPV感染率的影响最为显著。使用MβCD处理后，Vero E6细胞中HMPV00-GFP阳性率分别降低至对照组的75.4%、30.8%、9.3%，而在LLC-MK2中MβCD使HMPV00-GFP阳性率下降为对照组的72.0%、29.7%、17.2%。此外filipin、cytochalasin D、genistein等对HMPV感染率均有一定的影响，使HMPV阳性率呈现轻到中度的降低。这几种药物都是针对caveolae途径特异的或者与之相关的阻断剂，说明HMPV入胞和caveolae介导的胞吞途径密切相关。针对小凹蛋白的CAV2-siRNA作用后，HMPV感染率与正常对照相比也有明显下降，说明在两种细胞中CAV2蛋白参与了HMPV感染过程。　　结论：人偏肺病毒进入Vero E6及LLC-MK2细胞主要依赖于caveolae介导的胞吞途径。网格蛋白介导的胞吞在HMPV感染中所起的作用值得在未来被进一步研究。