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耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是一种具有极端抗性的微生物,对电离辐射(Ionizing radiation,IR)、紫外辐射、干旱、氧化胁迫和诱变剂等损伤因子均表现出极强的抗性,常作为研究DNA损伤修复的模式生物。耐辐射奇球菌的DNA损伤修复能力极强,这依赖于其高效的损伤修复途径。PprI蛋白被称为耐辐射奇球菌的辐射损伤响应开关,PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径与大肠杆菌中经典SOS响应机制有较大的差异,属于一种新型的损伤修复途径。而PprI作为这条途径的主角,发挥着至关重要的作用。PprI同源物IrrE的晶体结构已经解析,其中位于C端的GAF结构域功能尚未知晓。近年来的研究表明,GAF结构域主要在细胞内行使着信号分子受体的作用,说明其可能在PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径中发挥作用。以探究PprI的GAF结构域的功能为目的,开展了一系列研究,具体的实验结果如下:通过蛋白序列比对,揭示了 GAF结构域序列在同类菌株中具有同源性,通过解析PprI晶体结构并进行比对,进一步说明了 GAF结构域极为保守,研究这一结构域在奇球菌属中具有普适性;PprI是耐辐射奇球菌中响应损伤的关键蛋白,其主要包括:N端类锌指蛋白结构域、HTH结构域以及GAF结构域。敲除GAF结构域后,耐辐射奇球菌对UV和γ损伤的耐受性与野生型相比下降了两个数量级,几乎与PprI敲除株类似,表明GAF结构域对PprI完整功能至关重要;PprI可以通过切割转录抑制子DdrO,启动下游修复基因的表达。构建截短GAF结构域的PprI蛋白,以及GAF结构域蛋白,发现GAF结构域被截短后基本不会影响PprI蛋白的酶切活性;通过酵母双杂交检测GAF结构域在PprI与RNA聚合酶β亚基互作中的作用,发现截去GAF结构域影响PpIT176A与RNA聚合酶的互作能力,说明GAF结构域可能在RNA聚合酶β亚基的招募中发挥作用;比对 Deinococcus radiodurans 和 Deinnococcus deserti的 GAF 结构域,发现两者的GAF结构域都形成了一个类似空腔的结构,推测其可能会用于结合小分子信号物质,从而行使接受信号的功能;采用等温滴定量热法测定小分子cGMP、cAMP与GAF结构域的结合能力,结果表明,GAF结构域可以结合cGMP,不能结合cAMP;本研究通过一系列生理生化试验,初步探索了 PprI蛋白的GAF结构域在耐辐射奇球菌中的功能,证实GAF结构域通过影响RNA聚合酶的招募在耐辐射奇球菌紫外以及γ损伤抗性中发挥着重要作用,推测其可能是通过结合信号小分子cGMP来响应上游损伤。通过对该结构域的功能研究,为PprI-DdrO介导的DNA损伤响应途径上游响应机制研究奠定了基础。