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[背 景]RHBDD1是Rhomboid家族的新成员,在多种恶性肿瘤中过表达,包括非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）等,RHBDD1 表达水平升高与NSCLC患者总体低生存率相关。RHBDD1切割促凋亡Bcl-2家族蛋白BIK,高度调控细胞凋亡。因此,肿瘤组织中RHBDD1的高表达可以通过阻止细胞凋亡直接影响肿瘤的进展。RHBDD1催化裂解产生的片段可通过内质网相关降解机制（ER-associated degradation,ERAD）进行蛋白酶体降解。泛素化已被证实参与多种生理过程。泛素化过程中涉及多种ERAD成分,包括不同的E2结合酶、E3连接酶和E4因子,由此产生的K48连接的泛素化修饰促进蛋白酶体降解。泛素化相关蛋白在多种癌症的发展中具重要作用。[目 的]明确RHBDD1在NSCLC中的表达情况并探讨其临床意义;阐明RHBDD1与NSCLC细胞增殖的关系;探讨RHBDD1对细胞凋亡的影响及其可能的分子机制,旨在为RHBDD1成为非小细胞肺癌治疗的潜在可能性提供理论依据。[方 法]1.使用在线工具 GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/）分析来源于 TCGA（The Cancer Genome Atlas,https://portal.gdc.cancer.gov/）数据库的肺腺癌和肺鳞状细胞癌临床样本中RHBDD1的表达水平。同时,通过在线数据分析RHBDD1表达水平于非小细胞肺癌病理分期的相关性。此外,我们还使用Kaplan Meier Plotter数据库（http://kmplot.com/analysis/）分析RHBDD1表达量与非小细胞肺癌患者预后的相关性。除了应用数据库中的数据,我们也在所收集的临床样本中,应用RT-qPCR和免疫组织化学方法检测RHBDD1在NSCLC组织中的表达水平及定位。再者,我们还应用SPSS软件统计分析了 NSCLC组织中RHBDD1表达水平与临床病理因素的关系。2.免疫印迹法检测RHBDD1在非小细胞肺癌细胞系中的表达水平。在GENEBANK数据库中查找人RHBDD1基因序列,构建靶向RHBDD1基因的敲降和过表达载体,并在非小细胞肺癌细胞系H1299和A549中对RHBDD1进行敲降和过表达,通过CCK-8检测细胞活性,细胞克隆实验分析RHBDD1体外细胞增殖中的作用。流式细胞术实验检测RHBDD1对细胞周期的调节作用。进行异种移植瘤实验在小鼠体内验证RHBDD1对肿瘤生长的影响,免疫组化方法检测肿瘤增殖相关分子的表达水平。ELISA检测TGF-α分泌水平,免疫印迹测定EGFR/Raf/MEK/ERK信号通路的磷酸化水平,CCK-8实验评估EGFR或MEK抑制剂处理后H1299或A549细胞的活性,克隆形成实验检测EGFR或MEK抑制剂处理后H1299或A549细胞的增殖能力。3.流式细胞术检测细胞凋亡情况,免疫印迹实验测定剪切后的Caspase 3和Caspase 7的蛋白表达量以及全长BIK和降解后BIK的蛋白表达水平,免疫荧光实验检测K48泛素链（K48-Ub）的修饰水平。[结 果]1.RHBDD1在TCGA（癌症基因组图谱）数据库中的肺腺癌和肺鳞状细胞癌临床样本上调,在我们收集的非小细胞肺癌组织中也上调。同时,我们发现RHBDD1表达水平随着病理分期的进程而上调。与邻近癌旁组织相比,RHBDD1在NSCLC组织中显著上调,与病理性肿瘤分期相关,随着病理分期的增加而表达水平增加。此外,Kaplan生存分析显示NSCLC组织中RHBDD1表达较高的患者的总生存率低于RHBDD1表达较低的患者,同时,在收集的临床样本中发现RHBDD1的表达与NSCLC患者淋巴结转移、肿瘤大小、临床病理（pT）分期和Ki-67等指标显著相关。这些结果提示RHBDD1的异常表达可能促进非小细胞肺癌的发生发展。2.RHBDD1在所选NSCLC细胞系中蛋白表达水平高于对照细胞系。RHBDD1在H1299和A549细胞中具较高表达水平,故而被选择为本研究的实验细胞模型。在体外实验中,RHBDD1基因敲降可以抑制H1299和A549细胞增殖,导致细胞周期阻滞在G0/G1期,相反,RHBDD1过表达显著促进细胞增殖,增加细胞S期的细胞数目。基于裸鼠体内荷瘤实验发现,RHBDD1基因敲降显著降低瘤体的大小并抑制PCNA和Ki-67的表达水平,相反,RHBDD1的过表达显著增加了瘤体的大小并上调PCNA和Ki-67的表达水平。RHBDD1基因敲降抑制H1299或A549细胞中TGF-α分泌,进而抑制EGFR/Raf/MEK/ERK信号通路,相反,RHBDD1的过表达显著刺激TGF-α分泌,激活EGFR/Raf/MEK/ERK信号通路。EGFR或MEK抑制剂处理H1299或A549细胞后,细胞活性和增殖显著受到抑制。3.RHBDD1基因敲除导致BIK切割减少,反之亦然;应用蛋白酶体抑制剂处理细胞可阻断这种作用。同时,我们还检测了泛素化蛋白K48的修饰水平,发现RHBDD1在H1299细胞中的过表达促进内源性K48泛素化蛋白的积累。相反,RHBDD1的敲降进一步抑制K48多泛素化蛋白的表达。[结 论]1.通过在线工具分析及临床样本检测,结果发现RHBDD1在NSCLC组织中表达水平显著上调,并且生存分析显示RHBDD1表达较高的NSCLC患者的总生存率明显低于RHBDD1表达较低的NSCLC患者。同时,RHBDD1的表达与NSCLC患者淋巴结转移、肿瘤大小、Ki-67和pT分期指标显著相关,表明RHBDD1在NSCLC发生发展中具有重要作用。2.结合体内及体外研究结果,我们发现RHBDD1可通过调节EGFR/Raf/MEK/ERK信号通路从而促进细胞增殖及肿瘤生长。3.我们还发现RHBDD1可以通过促进BIK裂解进而抑制细胞凋亡和促进对癌细胞不利的蛋白（未折叠/错误折叠蛋白等）的降解,最终促进NSCLC的进展。