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背景:尿道狭窄是泌尿外科常见病,主要治疗方式是外科治疗,但手术治疗具有难度高、易复发、并发症多等特点,因此寻找新的治疗手段是泌尿外科医师急需解决的问题。尿道瘢痕的形成是尿道狭窄发病的始动环节,其中以I型胶原蛋白（CollagenⅠ,COL-Ⅰ）为主的细胞外基质蛋白的沉积是其进展的主要原因。因此,探索胶原蛋白异常沉积的机制对于尿道狭窄的防治具有非常重要的意义。COL-Ⅰ翻译后羟基化修饰,尤其是赖氨酸羟基化修饰对于维护胶原蛋白结构稳定、促进胶原蛋白沉积有着重要作用。本课题旨在探索胶原蛋白赖氨酸羟基化在尿道纤维化中的作用,揭示其通过促进COL-Ⅰ沉积,增加细胞外基质刚度激活压电型机械敏感离子通道组件1（piezoelectric1,PIEZO1）,进而通过钙离子-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium-cam-dependent protein kinase II,CAMKII）CAMKII/缺氧诱导因子-1α（hypoxia-Inducible factor 1-alpha,HIF-1α）信号通路增加赖氨酸羟基化酶（procollagen-lysine,2-oxoglutarate5-dioxygenases,PLODs）的表达,使纤维化过程陷入恶性循环,推进纤维化-再纤维化的进行性发展。本课题将为尿道纤维化研究领域提供一个新的思路,为尿道狭窄的预防与治疗打下坚实的基础。方法:1、利用原子力显微镜（atomic force microscope,AFM）量化人体狭窄尿道组织与正常尿道组织基质刚度;采用液相色谱质谱/质谱联用（liquid chromatography tandem mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）技术对3例人体狭窄尿道组织和3例正常尿道组织胶原蛋白羟基化修饰水平进行检测分析。2、探究胶原蛋白翻译后修饰在尿道纤维化中的调控机制,收集3例人体狭窄尿道组织与3例人体正常尿道组织进行转录组学测序,发现人体狭窄尿道组织与正常尿道组织中的差异基因,采用生物信息学方法预测胶原蛋白赖氨酸羟基化修饰在尿道纤维化中的调控机制。3、组织免疫荧光及蛋白质免疫印迹法（western blot,WB）检测人体狭窄尿道组织和正常尿道组织中PIEZO1、PLODs、p CAMKII、HIF-1α以及纤维化指标COL-Ⅰ、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达情况。利用WB、细胞免疫荧光、膀胱尿道造影等方法在细胞和动物层面上验证PIEZO1是否通过上调CAMKII/HIF-1α信号通路增加胶原蛋白赖氨酸羟基化水平参与尿道纤维化。4、查阅文献寻找赖氨酸羟基化抑制剂,利用cck8实验筛选出赖氨酸羟基化抑制剂2,2’-联吡啶发挥作用的最佳有效浓度和作用时间。利用wb、苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,H＆E）和Masson染色以及膀胱尿道造影在细胞层面和动物层面验证2,2’-联吡啶延缓尿道纤维化进展的有效性。结果:1、AFM测量人体正常尿道组织基质刚度为4.2±1.92k Pa,狭窄尿道组织基质刚度为40.0±2.32k Pa。通过提取人体狭窄尿道组织与正常尿道组织的胶原蛋白进行LC-MS/MS检测,发现一共有1082个位点发生羟基化修饰,其中976个位点发生赖氨酸羟基化修饰,106个位点发生脯氨酸羟基化修饰,赖氨酸羟基化修饰占比90.2%。其中在有统计学差异的49个赖氨酸羟基化修饰位点中,有42个赖氨酸羟基化修饰位点表达增高,7个赖氨酸羟基化修饰位点表达降低。同时发现狭窄尿道组织中COL-Ⅰ的沉积较正常尿道组织显著增加。2、人体狭窄尿道组织与正常尿道组织转录组学共检测出1983种差异m RNA,其中546种m RNA表达上调,1437种m RNA表达下调,其中赖氨酸羟基化酶PLOD1、PLOD2、PLOD3的表达上升,除此之外PIEZO1、HIF-1α以及纤维化指标COL-Ⅰ、α-SMA的表达上升。通过生物信息学方法预测发现PIEZO1可能通过调控CAMKII/HIF-1α影响PLODs的表达,影响胶原蛋白的稳定性从而在尿道纤维化的进展中发挥作用。3、组织免疫荧光及免疫印迹（WB）发现人体和大鼠狭窄尿道组织中PLODs、PIEZO1、p CAMKII、HIF-1α以及纤维化指标COL-Ⅰ、α-SMA的表达较正常尿道组织高。利用人尿道成纤维细胞模型,发现基质刚度的升高可激活PIEZO1,活化的PIEZO1可磷酸化CAMKII调控HIF-1α表达,致使PLODs的表达增加,胶原蛋白稳定性增加。4、利用人尿道成纤维细胞模型,发现2,2’-联吡啶能抑制PLODs以及纤维化指标COL-Ⅰ、α-SMA的表达。在尿道狭窄大鼠模型中通过局部注射2,2’-联吡啶能延缓尿道狭窄的发生。结论:PIEZO1通过上调CAMKII/HIF-1α信号通路增加胶原蛋白赖氨酸羟基化水平促进尿道纤维化的进展,纤维化的进展促进基质刚度增加,正反馈调控PIEZO1的表达和激活。图38幅,表16个,参考文献120篇.