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[研究背景]肌成纤维细胞是组织器官损伤修复过程中产生重要细胞外基质(胶原蛋白)物质的关键效应细胞,被认为是组织器官损伤修复和再生的关键参与者,在许多纤维化疾病发生中起到重要作用。循环纤维细胞(circulating fibrocytes,CF)是迁移至损伤组织转化为肌成纤维细胞的主要来源之一,在肺纤维化形成中起着重要作用已被新近研究证明。据此推测CF细胞对急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的损伤修复和重建及预后评价可能有着重要作用。本研究旨在探讨CF细胞在LPS诱导ALI中修复损伤的作用和对ALI/ARDS病人预后评价的作用,确定CF是ALI/ARDS病人预后评价的一个可靠、有价值的指标。第一部分循环纤维细胞在LPS诱导ALI中修复损伤的作用研究[目的]建立LPS诱导小鼠ALI模型,探讨CF细胞的趋化途径、定位以及与修复损伤之间的关系,阐明CF细胞在ALI中修复损伤的作用。[方法]1)昆明小鼠随机分为2组:对照组(气管滴注等量PBS);损伤组(气管滴注LPS5mg/kg)。密度梯度离心法体外分离培养外周血单个核细胞,倒置相差显微镜镜下观察细胞形态,流式细胞术分别鉴定循环纤维细胞;流式细胞术检LPS诱导ALI发生后不同时间(第1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d)外周血循环纤维细胞数量变化:Gustavo Matute-Bello和Hubner病理学评分方法在光镜下观察肺组织损伤和肺纤维化程度;免疫组化法观察肺组织中COL-1蛋白表达。2)昆明小鼠随机分为2组,对照组(气管滴注PBS),损伤组(气管滴注LPS5mg/kg),10天后对照组小鼠尾静脉推注PBS,而损伤组再随机分为ALI-PBS组(气管滴注LPS+尾静脉推注PBS)和阻断剂组(气管滴注LPS+尾静脉推注AMD3100 2.5mg/kg)。酶联免疫夹心法(ELISA)检测不同时间(第1d、3d、5d、7d、14d、21d和28d)小鼠外周血外周血中CXCL12含量。[结果]1.体外培养ALI小鼠单个核细胞形态学鉴定:外周血单个核细胞呈圆形;自分离后第2天开始,可呈现明显聚集趋势;第3天细胞集落及梭形细胞数量明显增加;第7天细胞集落开始减少,梭形细胞增多;第10天细胞集落完全消失,大部分贴壁细胞呈典型梭形外观;第12天细胞呈典型梭形外观,且排列规律。2.体外培养ALI小鼠单个核细胞表面标志物鉴定:流式细胞术检测可以看到表达CD45+COL-1+双阳性细胞,可以被认定为循环纤维细胞。3.肺组织病理形态结构改变:①HE染色肺组织病理形态学光镜下观察显示:对照组小鼠肺组织结构正常,肺泡腔内无明显渗出,肺泡间隔未见增宽,无明显水肿、炎症、无纤维化等特殊改变;损伤组肺组织在3d、7d时可以发现肺泡壁增厚,肺泡间隔断裂,肺泡腔内渗出物填充,肺间质炎性细胞渗出等细胞炎改变;②Masson染色肺组织病理形态学光镜下观察显示:对照组小鼠肺组织中少见蓝色胶原纤维阳性表达;损伤组小鼠肺组织3d时就可以发现少许蓝色胶原纤维在肺泡破坏严重区出现,14d和28d时蓝色胶原纤维在肺泡破坏严重区出现增加。4.循环纤维细胞数量与肺组织损伤程度及肺纤维化评分相关性:损伤组外周血循环纤维细胞数量与肺损伤程度呈现正相关性(r=0.815,P<0 01);损伤组外周血循环纤维细胞数量与肺损伤后纤维化评分呈现正相关性(r =0.904,P<0.1)。5.肺组织中COL-1表达水平:对照组小鼠肺组织内Ⅰ型胶原蛋白(COL-1)有少量的表达;损伤组第7、14、28天时肺组织标内Ⅰ型胶原(COL-1)蛋白表达均明显高于对照组(P<0.05)。6.外周血中细胞因子CXCL12含量变化:损伤组小鼠外周血液中CXCL12含量明显高于对照组(5843.23vs1826.49,P<0.05);阻断剂组外周血液中CXCL12含量明显低于损伤组降低(2913.70vs 823.,P<0.05),但仍高于对照组(5843.23vs1826.49,P<0.05)。[结论]1.循环纤维细胞由骨髓释放入外周血液,迁移至急性肺损伤的受损肺组织中,CXCL12/CXCR4起着重要作用。2.循环纤维细胞数量与肺组织损伤程度及肺纤维化评分呈正相关性,提示循环纤维细胞参与急性肺损伤后纤维化修复和重建过程。第二部分循环纤维细胞在ALI/ARDS病人评价预后的作用研究[目的]研究ALI/ARDS病人外周血液中循环纤维细胞数量变化与肺损伤程度和死亡率之间的关系,确定循环纤维细胞作为对ALI/ARDS病人预后评价的可靠有价值指标。[方法]全血溶解流式细胞技术对32名ALI/ARDS病人和23例健康人外周血液中CD45+Col-1+循环纤维细胞计数细胞数量;胸部X线观察肺泡萎陷、肺不张等肺结构变化,测定氧合指数(PaO2/FiO2)、呼气末正压(PEEP)水平和肺顺应性等肺功能指标,计算Murray肺损伤评分;综合各项指标评价ALI/ARDS病人外周血循环纤维细胞数量变化与肺损伤程度和死亡率之间的相关性。[结果]1.研究对象资料:对照组健康人、ALI组和ARDS组病人年龄和性别构成无明显差异,但ARDS组病人肺损伤程度评分和28天死亡率均高于比ALI组(P<0.05)。2.ALI/ARDS病人外周血循环纤维细胞数量变化:ALI/ARDS组病人外周血循环纤维细胞数量明显高于对照组(6.2%vs0.9%,P<0.05),ARDS组病人外周血循环纤维细胞数量显著高于ALI组(16.5%vs2.9%,P<0.01);ALI/ARDS病人外周血循环纤维细胞数量增加与肺损伤程度评分之间呈现正相关性(P<0.01);在28天观察期内,死亡组病人外周血循环纤维细胞数量大约是生存组的5倍(14.8%vs2.9%,P<0.01),而死亡组内和生存组内ARDS病人外周血循环纤维细胞分别高于ALI病人(18.2%vs6.1%,P<0.01;5.7%vs2.8%,P<0.05);3.Kaplan-Meier生存曲线绘制:ALI/ARDS病人在28天观察期内生存14人,死亡18人。其中ALI组存活12人,平均生存时间为24.5天,ARDS组存活2人,平均生存时间为13.8天。4.ALI/ARDS死亡率评价预测价值ROC曲线:外周血循环纤维细胞>5.85%预测ALI/ARDS病人28天死亡率具有最佳的预测能(敏感度:0.889,特异性:0.928)。[结论]ALI/ARDS病人外周血循环纤维细胞数量与肺功能指标和肺损伤纤维化程度密切相关,可作为对ALI/ARDS病人预后评价可靠、有价值的指标。