论文部分内容阅读
棉花是我国重要的经济作物,在国民经济中占据着非常重要的战略地位。棉田杂草丛生,会严重影响棉花的产量和质量。棉田化学除草是棉花生产中降低成本、提高经济效益的根本途径。草甘膦是一种灭生性除草剂,具有广谱、高效、低毒和无残留的优点;但是,其在杀灭田间杂草的同时,也会伤害农作物。利用基因工程技术,培育和推广具有草甘膦抗性的棉花新品种,对于利用草甘膦进行棉田化学除草具有重要意义。目前,国内可用于商业化的抗除草剂棉花尚未见报道。开展具有自主知识产权的抗除草剂转基因棉花的研究,对我国棉花产业具有重大意义。本研究运用农杆菌介导法,将具有自主知识产权的抗草甘膦基因G2-aroA转入珂字棉312中,获得了抗草甘膦转基因棉株,并对其进行了抗性鉴定和分子生物学分析,为该种质的开发利用提供了科学依据。研究结果如下:1.抗草甘膦转基因棉花的获得以珂字棉312下胚轴为外植体,用卡那霉素作为抗性筛选剂,通过农杆菌介导法,将菊花Rubisco小亚基基因启动子驱动的G2-aroA基因导入了棉花基因组中,获得了10个转化事件（T0）。这些转化事件,都能正常开花结实。卡那霉素、草甘膦筛选试验和PCR检测、Southern Blot等分子生物学分析,均证实G2-aroA基因已成功导入了棉花基因组中。2.转基因棉花后代遗传分析T0代转基因植株自交种子,种成株行（T1）。田间卡那霉素抗性鉴定结果,经χ2卡方检验,表明各转化子（T1）均符合单位点插入的3:1分离规律,与分子生物学检测结果一致。3.转基因棉花草甘膦抗性鉴定对田间性状优异的抗草甘膦转基因棉花BG2-7,用浓度分别为0‰、1‰、2‰、4‰、8‰和10‰的草甘膦溶液,进行喷施鉴定。非转基因棉花对草甘膦非常敏感,2‰草甘膦（大田推荐施用浓度）处理就全部死亡。转基因棉花,2‰草甘膦处理能够正常生长;随草甘膦浓度的增加,转基因棉花的生长受抑制情况逐渐明显;10‰草甘膦（5倍大田推荐浓度）处理仍能缓慢生长,开花结实。草甘膦抗性鉴定结果表明,转基因棉花BG2-7具有较高的草甘膦抗性。4.转基因棉花BG2-7外源插入基因的侧翼序列分析通过TAIL-PCR和普通PCR扩增,获得了转基因棉花BG2-7外源DNA插入片段的侧翼序列。本研究所导入的外源基因,插入到了棉花基因组第十一号染色体上,5ˊ端位于染色体的第61,253,333处;棉花基因组序列与外源基因5ˊ端之间有31 bp的棉花微卫星序列;外源基因Left boder缺失84 bp碱基,Right boder缺失298 bp碱基,棉花基因缺失30 bp碱基;。5.转基因棉花BG2-7特异性检测方法的建立依据获得的侧翼序列信息,分别设计BG2-7转化事件外源基因5ˊ端和3ˊ端特异性PCR检测引物。经筛选,分别确定引物GTCATAACGTGACTCCCTTAATTCTCC/CCTATTACACGGCTATGC为特异性PCR5ˊ端检测引物,引物TCCTTTCGCTTTCTTCCCTT/ACACTTACATGGCGTCTTCT为3ˊ端检测引物,建立了BG2-7转化事件的特异性检测方法。5ˊ端的检测灵敏度,可以达到44个拷贝;3ˊ端的检测灵敏度可以达到88个拷贝。另外,还依据侧翼序列信息,设计了复合PCR引物。引物ATGGAAGGGCTGTTGATACA/TCTGACATCATGGATCGCAA扩增棉花基因组序列,引物TCGCTTTCTTCCCTTCCTTT/TCTGACATCATGGATCGCAA扩增3ˊ端特异性序列,分别进行PCR扩增,建立了BG2-7转化事件纯合子的筛选方法。